新型致病性ZNHIT3变异导致胎儿水肿及致死性并破坏snoRNP组装

《Nucleic Acids Research》：New pathogenic ZNHIT3 variants causing fetal hydrops and lethality disrupt snoRNP assembly

　　

ZNHIT3是box C/D小核仁核糖核蛋白（snoRNP）复合物生物发生所必需的保守组装因子，而该复合物是核糖体生物发生的关键参与者。ZNHIT3的致病性变异导致进行性脑病伴水肿、高峰节律紊乱和视神经萎缩（PEHO）综合征，这是一种通常在出生后识别的严重神经发育障碍。本文描述了来自同一家庭的两个胎儿，其在妊娠早期中段出现孤立性水肿，导致宫内死亡。全基因组四人家系测序鉴定出两个新的ZNHIT3变异：c.40T > C；p.(Cys14Arg)和c.251_254del；p.(Glu84Alafs*8)，分别遗传自健康的父母，在两个胎儿中均以复合杂合等位基因形式存在。使用HEK293T细胞中的ZNHIT3敲低-回补系统进行的功能研究表明，细胞增殖受损、凋亡增加，并揭示了两个变异的不同分子后果。一个变异产生稳定的ZNHIT3蛋白，但缺乏与NUFIP1相互作用及有效组装box C/D snoRNP所需的区域；而第二个变异降低了ZNHIT3蛋白丰度。两个变异均损害snoRNP组装，降低特定box C/D snoRNA的丰度，并导致核糖体RNA（rRNA）2′-O-甲基化的位点特异性缺失。这些缺陷伴随着核糖体生物发生的变化和翻译输出的降低。总之，研究结果将ZNHIT3缺陷相关的表型谱扩展至包括严重的产前疾病，并证明box C/D snoRNP组装受损和rRNA修饰改变是致病性ZNHIT3变异的汇聚性分子后果。

研究背景：蛋白质稳态调控对细胞生存和发育至关重要，核糖体作为蛋白质合成的执行者，其生物发生受到包括蛋白质和非编码RNA在内的庞大因子网络的严格调控。核糖体RNA（rRNA）的合成、加工、折叠和化学修饰是核糖体生物发生的关键步骤，其中高丰度的小核仁RNA（snoRNA）引导真核生物中大多数rRNA化学修饰。snoRNA根据保守序列motif分为两大类：以C/D和C′/D′序列motif为特征的SNORD主要引导2′-O-甲基化，以H/ACA元件为特征的SNORA主要引导尿苷向假尿苷的转化。snoRNA与一组进化上保守的核心蛋白（SNU13、NOP56、NOP58和2′-O-甲基转移酶原纤维蛋白）结合形成snoRNP复合物，引导和催化rRNA的位点特异性修饰。box C/D snoRNP的组装受到严格调控，需要一组从酵母到人类保守的专用反式作用组装因子，并受到HSP90-R2TP等分子伴侣的协同辅助。ZNHIT3（锌指HIT型含蛋白3；酵母中为Hit1）是关键box C/D snoRNP组装因子，与支架蛋白NUFIP1（酵母中为Rsa1）形成稳定复合物。在酵母中敲除HIT1基因导致box C/D snoRNA稳态水平降低，损害snoRNP组装和核糖体生物发生。小鼠模型研究强化了ZNHIT3在核糖体生物发生中的核心作用，并揭示其破坏导致早期胚胎发育过程中翻译的下游缺陷。在人类中，ZNHIT3的致病性变异是PEHO综合征的遗传学基础，该综合征以出生后进行性小脑萎缩、水肿、高峰节律紊乱、视神经萎缩、精神运动发育停滞和预后不良为特征。目前仅报道了两种与PEHO相关的错义ZNHIT3变异，均位于蛋白质的Zf-HIT结构域内：芬兰人群中的奠基者变异Ser31Leu（S31L）和在一名患者中与S31L以复合杂合状态共同鉴定的Cys14Phe（C14F）。细胞培养研究表明ZNHIT3-S31L变异使蛋白质不稳定，降低稳态蛋白水平；在芽殖酵母中模拟这些变异的研究表明，PEHO患者中鉴定的致病性错义变异降低Hit1蛋白稳态水平，伴随box C/D snoRNA细胞水平显著降低、位点特异性rRNA修饰改变以及rRNA加工和细胞翻译受损。然而，致病性ZNHIT3变异的分子后果仍知之甚少，且此前未报道过与双等位ZNHIT3变异相关的产前病例。本研究报道了两个新的ZNHIT3变异以复合杂合状态与严重胎儿表现相关，以胎儿水肿和胎儿致死为特征，旨在通过遗传学、生物化学和细胞学方法揭示这些新鉴定的变异如何破坏ZNHIT3功能、损害snoRNP组装、改变snoRNA丰度和rRNA修饰，并最终损害核糖体生物发生和翻译。该研究发表于《Nucleic Acids Research》。

关键技术方法：研究人员对一例经历多次胎儿丢失的家庭进行了临床和病理评估，对两个受累胎儿及父母进行全基因组四人家系测序以鉴定致病变异。构建了HA标签ZNHIT3野生型及变异体（C14R、C14F、S31L、Δ251–254）表达质粒和shRNA敲低质粒，在HEK293T细胞中建立ZNHIT3敲低-回补系统。利用免疫印迹、免疫沉淀、免疫组织化学、流式细胞术（凋亡和细胞周期分析）、RT-qPCR、RiboMethSeq（rRNA 2′-O-甲基化检测）、Northern blot（pre-rRNA加工和snoRNA分析）以及嘌呤霉素掺入实验（全局翻译检测）进行评估。胎儿肺组织和脑组织来源于临床尸检，父母PBMC及淋巴母细胞系用于对照分析。

研究结果：
临床发现与新的致病性ZNHIT3变异鉴定：健康无关的27岁父母因多次胎儿丢失转诊遗传咨询。第一次妊娠15周时因胎儿水肿发生胎儿死亡，病理显示女性胎儿生长参数正常、无畸形但存在胎盘水肿迹象，神经病理检查受限，染色体异常检查阴性。第二次妊娠8周早期流产未行胎儿检查。第三次妊娠15+3周超声显示全身性水肿和心包积液，17周医学终止妊娠，尸检显示轻度水肿男性胎儿，以四肢水肿为主，伴轻度小颌畸形但无内脏畸形，神经病理检查显示测量值和成熟度与孕龄一致、无微观异常。微阵列分析和溶酶体贮积病检查正常。全基因组测序在两个胎儿中鉴定出ZNHIT3基因两个变异，分别遗传自父母。父源变异NM_004773.4：c.40T > C，p.(Cys14Arg)，位于外显子1，在人群对照数据库中频率极低，所有计算机预测工具均支持其有害性（CADD评分27.9），且此前有报道同一氨基酸的另一替换与PEHO综合征相关。母源变异NM_004773.4：c.251_254delAAGA，位于外显子4，为4核苷酸移码缺失，预测导致提前终止密码子[p.(Glu84Alafs*8)]。gnomAD数据库中未报道这两个变异的纯合携带者。由此鉴定出两个此前未报道的ZNHIT3变异，其致病表现与既往报道的ZNHIT3变异不同。

ZNHIT3变异不改变脑组织构筑但差异影响蛋白丰度和稳定性：通过免疫组织化学比较受累胎儿与两个年龄匹配对照胎儿（约17周）脑组织中ZNHIT3表达，所用抗体识别两个变异蛋白均存在的N端表位。组织学检查显示此发育阶段皮质组织、神经元迁移或小脑叶化无明显异常，ZNHIT3总体表达模式在受累与对照组织间相当，在发育脑的神经元群体和生发区观察到显著染色。结果表明两个新变异不在妊娠中期导致脑架构重大缺陷或可检测的ZNHIT3表达变化，提示其后果源于组织学分析无法显现的分子缺陷。在HEK293T细胞中表达HA标签WT或变异ZNHIT3，通过CHX追踪实验评估蛋白丰度和稳定性。母源遗传的c.251_254delAAGA变异预测引入提前终止密码子并去除含NUFIP1结合结构域的ZNHIT3 C端区域，研究人员构建了缺失相应C端片段的截短构建体（Δ251–254模型变异）。C14R变异相对WT明显降低ZNHIT3稳态水平，而Δ251–254变异显示蛋白丰度增加。既往PEHO相关变异也显示相对WT降低的稳态水平。内源性和HA标签WT ZNHIT3半衰期相似，表明HA标签和表达系统未实质影响蛋白周转。Δ251–254变异相对WT显示稳定性增加，与其升高的稳态丰度一致，其余变异尽管蛋白水平降低但衰减率与WT相似。结果表明两个新变异对蛋白稳态有不同影响：C14R降低稳态蛋白丰度，而Δ251–254变异更稳定，表明ZNHIT3变异可通过蛋白去稳定化以外的机制扰动功能。

ZNHIT3变异不改变亚细胞定位但损害细胞生长：WT ZNHIT3和新鉴定的变异在HEK293T细胞质和核组分中均可检测到，分级分离质量通过GAPDH（细胞质标志物）和内源性ZNHIT6（另一种box C/D snoRNP生物发生因子，具有相似核质分布）验证。WT与变异蛋白间未观察到定位的实质性差异，表明变异对蛋白丰度和稳定性的影响不太可能源于亚细胞运输改变。使用两种独立shRNA建立稳定ZNHIT3敲低HEK293T细胞系，mRNA和蛋白水平敲低效率均>80%。ZNHIT3敲低显著降低细胞增殖，WT ZNHIT3表达可恢复增殖，而两个变异均不能挽救生长缺陷。表达C14R的细胞显示与敲低对照和既往PEHO变异相似的生长曲线，而Δ251–254变异产生更显著的增殖降低。结果表明致病性ZNHIT3变异通过不同机制损害细胞适应性，C14R和Δ251–254对蛋白丰度有相反效应但均损害细胞生长；Δ251–254变异尽管稳定性增加却表现出更强的生长表型，提示特定分子功能的丧失而非单纯蛋白丰度降低是其致病性的基础。

ZNHIT3变异诱导凋亡并改变细胞周期进程：Annexin V/PI染色显示ZNHIT3敲低显著增加凋亡，WT ZNHIT3表达可挽救此表型。C14R变异相对WT回补导致凋亡轻度增加，而Δ251–254变异诱导显著更强的凋亡反应，与其更严重的生长缺陷一致。WT ZNHIT3表达相对敲低对照降低p53丰度，而Δ251–254变异导致p53稳态水平升高，C14R变异效应较温和。表达Δ251–254变异的细胞中MDM2水平降低，但各条件下p21丰度未观察到显著一致变化。PI染色和流式细胞术显示ZNHIT3敲低相对WT回补细胞降低G1期细胞比例并增加G2/M群体。WT ZNHIT3表达恢复此分布，而Δ251–254变异未能挽救该缺陷并显示与敲低对照相似的 profile。表达C14R变异的细胞显示中间表型，以G1轻度降低和G2/M增加为特征。结果表明ZNHIT3是正常细胞存活和细胞周期进程所必需的，两个致病性变异差异损害这些过程，Δ251–254变异对凋亡和细胞周期进程产生最强效应，与其对细胞适应性更严重的影响一致。

Δ251–254变异破坏与snoRNP组装因子的相互作用：Δ251–254变异尽管蛋白稳定性增加却产生最严重的细胞表型，促使研究人员研究致病性变异是否差异影响ZNHIT3在box C/D snoRNP生物发生中的分子功能。在ZNHIT3敲低HEK293T细胞中表达EV、HA标签WT或变异ZNHIT3，通过免疫印迹测定关键组装因子和核心snoRNP蛋白的稳态水平。表达C14R变异或EV的细胞相对WT回补细胞降低NUFIP1丰度，而表达Δ251–254变异的细胞显示NUFIP1稳态水平增加。表达EV的细胞中PIH1D1和15.5K稳态水平也显著降低。相比之下，表达任一ZNHIT3变异的细胞中RPAP3、15.5K和Nop58的稳态水平无显著变化。通过免疫沉淀分离HA标签WT或变异ZNHIT3蛋白，免疫印迹分析相关组装因子和snoRNP蛋白。WT ZNHIT3与NUFIP1和PIH1D1共纯化，而Δ251–254变异未能共纯化NUFIP1或PIH1D1，与含NUFIP1结合结构域的C端区域缺失一致。C14R变异保留与NUFIP1和PIH1D1的相互作用，但相对WT ZNHIT3回收的每种蛋白量减少。结果表明两个致病性变异通过不同分子机制损害ZNHIT3功能：C14R变异主要降低ZNHIT3丰度，而Δ251–254变异是稳定的蛋白质但未能与含NUFIP1和PIH1D1的复合物结合。与主要通过蛋白去稳定化起作用的其他已表征致病性ZNHIT3变异不同，Δ251–254变异破坏有效box C/D snoRNP组装所需的蛋白质-蛋白质相互作用，这为尽管蛋白稳定性增加却观察到严重细胞缺陷提供了合理解释。

ZNHIT3变异降低特定box C/D snoRNA的丰度：使用RT-qPCR定量ZNHIT3敲低HEK293T细胞回补WT或变异ZNHIT3后一组靶向box C/D snoRNA的稳态水平。该组包括代表不同功能类别的box C/D snoRNA：引导rRNA 2′-O-甲基化的C/D snoRNA、参与pre-rRNA加工的C/D snoRNA、孤儿box C/D snoRNA，以及作为对照的若干box H/ACA snoRNA。表达任一YZNHIT3变异均降低一部分box C/D snoRNA的丰度，而测试的box H/ACA snoRNA基本不受影响。降低最显著的包括SNORD21、SNORD72、SNORD91B、SNORD93、SNORD125和SNORD126。相比之下，主要参与pre-rRNA加工的若干box C/D snoRNA以及所有测试的box H/ACA snoRNA相对表达WT ZNHIT3的细胞显示很小或无变化。Δ251–254变异通常产生更强效应，与该变异在结合关键snoRNP组装因子方面的缺陷一致。Northern blot验证显示SNORD72和SNORD125在表达Δ251–254变异的细胞中相对WT对照降低，与RT-qPCR结果一致。结果表明致病性ZNHIT3变异选择性损害一部分box C/D snoRNA的积累。

ZNHIT3变异改变患者组织中功能重要位点的rRNA 2′-O-甲基化：对来自第三次妊娠受累胎儿 preserved 肺组织、两个年龄匹配对照胎儿和父母PBMC的RNA进行RiboMethSeq分析。尽管PEHO综合征主要影响神经系统，但肺是常规胎儿尸检后唯一可用于RNA分析的冷冻组织；鉴于box C/D snoRNP生物发生和rRNA 2′-O-甲基化的普遍需求，这些过程的缺陷预期可在中枢神经系统外检测到。RiboMethSeq分析鉴定出受累胎儿样本相对胎儿和父母对照的多个低甲基化rRNA残基。受影响最显著的位点包括小核糖体亚基的18S-Am576和18S-Cm1440，以及大亚基的28S-Gm1303、28S-Am1310、28S-Gm4166和28S-Um4590。若干低甲基化残基是表达ZNHIT3变异细胞中丰度降低的box C/D snoRNA的靶标，提供了缺陷性snoRNP生物发生与改变rRNA修饰之间的直接联系。将低甲基化残基映射到人类核糖体三维结构上，受影响修饰位点分布在整个核糖体两个亚基而非聚集在单一区域。在大亚基中，28S-Gm1303和28S-Am1310形成位于肽基转移酶中心附近的保守相邻修饰对，28S-Gm4166定位于亚基间界面的保守Helix 69区域，28S-Um4590定位于参与转移RNA移动和核糖体动力学的L1 stalk/E-site区域。将受影响位点与已发表的rRNA 2′-O-甲基化变异性分析及既往芽殖酵母Hit1模型研究比较，患者组织中鉴定的六个低甲基化位点中五个对应此前报道的可变或部分修饰的2′-O-甲基化位点，而28S-Gm4166被认为是稳定修饰位点；28S-Gm4166具有进化上保守的酵母对应位点25S-Gm2619，在Hit1功能障碍的芽殖酵母PEHO模型中也发现低甲基化。另一个受影响位点18S-Cm1440是多种人类实验系统中报道的最部分修饰的rRNA甲基化位点之一。结果表明致病性ZNHIT3变异导致rRNA 2′-O-甲基化的选择性变化，至少对一个保守位点与酵母Hit1模型中观察到的变化重叠；受影响位点涵盖从高度可变位点（如18S-Cm1440）到低变异性位点（如28S-Am1310）和静态位点（如28S-Gm4166）的广谱修饰变异性，提示ZNHIT3功能障碍足以损害box C/D snoRNP活性以影响部分修饰和通常稳定的rRNA甲基化位点。

Δ251–254变异损害pre-rRNA成熟和核糖体生物发生：使用Northern blot分析ZNHIT3敲低HEK293T细胞表达EV、WT或ZNHIT3变异后的rRNA加工，使用与人pre-rRNA转录本5′-ETS、ITS1和ITS2区域互补的探针以及成熟18S、28S和5.8S探针，GAPDH转录本作为加载对照。表达EV的ZNHIT3敲低细胞显示前体rRNA（包括47S、30S、21S、18S-E）以及成熟rRNA的降低，与核糖体生物发生的早期缺陷一致。表达WT ZNHIT3和C14R变异的细胞显示大多数pre-rRNA种类水平相似，而表达Δ251–254变异显著降低47S和34S pre-rRNA丰度，提示这些细胞中早期pre-rRNA中间体积累受损。含ITS1中间体分析揭示与Δ251–254变异相关的更广泛缺陷：相对WT对照细胞，表达Δ251–254显著降低30S、21S和18S-E种类水平，表明小核糖体亚基生产所需前体的成熟受损；C14R变异对这些中间体丰度无显著影响。表达Δ251–254变异的细胞相比WT细胞也积累显著更低水平的12S pre-rRNA，而C14R变异的加工谱基本与WT相似。与pre-rRNA成熟的变化一致，表达Δ251–254变异的细胞中成熟18S、28S和5.8S rRNA水平降低，类似于ZNHIT3敲低细胞；相比之下C14R变异对成熟rRNA丰度无显著影响。结果表明Δ251–254变异导致核糖体生物发生的广泛缺陷，以参与小亚基和大亚基成熟的pre-rRNA中间体积累降低为特征；相比之下C14R变异尽管降低ZNHIT3蛋白丰度但对pre-rRNA加工几乎无可检测的影响。这些发现进一步支持Δ251–254相关的严重细胞表型源于snoRNP组装和核糖体生产所需关键分子功能的破坏。

ZNHIT3变异降低翻译输出：使用嘌呤霉素掺入实验测量全局蛋白质合成，新合成蛋白用嘌呤霉素脉冲标记并通过抗嘌呤霉素抗体免疫印迹检测。表达任一致病性ZNHIT3变异相对WT ZNHIT3显著降低嘌呤霉素掺入，表明翻译输出降低。表达Δ251–254变异的细胞中观察到最显著的降低，与其对snoRNP组装、rRNA修饰和pre-rRNA加工的实质性影响一致。值得注意的是，C14R变异尽管对pre-rRNA成熟的缺陷较小也降低翻译，提示翻译输出对ZNHIT3功能降低特别敏感，可能受稳态核糖体生物发生分析未完全捕获的缺陷影响；与其蛋白丰度降低一致，C14R变异可能导致ZNHIT3活性的部分丧失，足以损害蛋白质合成而不产生显著的pre-rRNA加工缺陷。snoRNP组装、snoRNA积累、rRNA修饰、pre-rRNA成熟和翻译缺陷的汇聚支持ZNHIT3在维持核糖体功能和蛋白质组稳态中的关键作用。

讨论部分总结：PEHO综合征是一种罕见神经发育障碍，最常与ZNHIT3的芬兰奠基者变异p.Ser31Leu相关。本研究通过描述两个携带复合杂合ZNHIT3变异p.C14R和p.Δ251–254的非芬兰同胞，扩展了ZNHIT3相关疾病的临床和分子谱。据研究人员所知，这些是首批与双等位ZNHIT3变异相关的产前病例，以早期胎儿水肿为特征，一次妊娠导致宫内死亡，另一次在产前诊断后接受医学终止妊娠。这种异常严重的表现拓宽了ZNHIT3缺陷相关的表型谱，并证明ZNHIT3功能破坏可在经典出生后PEHO综合征神经表现出现之前很久就损害人类发育。ZNHIT3的发育表达模式与PEHO综合征的临床表现一致：在胎儿生发区、脑干结构、小脑通路、胼胝体和视束中观察到强表达，与PEHO综合征中最严重受累的解剖区域密切对应。尽管本研究中检查的15周胎儿无明显神经病理异常，但这一发现与神经表型的进行性性质相符；小头畸形通常在婴儿期发展，而小脑和视神经萎缩在出生后疾病进展中出现，提示ZNHIT3缺陷的发育后果在神经发育后期对核糖体生产和蛋白质合成需求特别高时最为明显。尽管ZNHIT3长期以来被认为是box C/D snoRNP组装机器的组分，但致病性ZNHIT3变异的分子后果仍知之甚少。通过比较两个新的疾病相关变异，本研究证明致病性ZNHIT3变异通过不同机制损害细胞功能。与既往报道的PEHO相关变异C14F和S31L相似，C14R变异主要降低ZNHIT3蛋白丰度，进一步支持蛋白去稳定化是ZNHIT3相关疾病的复发性致病机制。值得注意的是，现在已在Cys14残基鉴定出两个独立的疾病相关替换，提示该N端区域对损害ZNHIT3稳定性的氨基酸替换特别敏感。相比之下，在异位表达系统中，Δ251–254等位基因产生可检测且相对稳定的截短蛋白，但功能受损，从而将蛋白丰度与活性解偶联；该变异在分子和细胞读数中表现出显著更大的效应，包括与snoRNP组装因子相互作用缺陷、一部分box C/D snoRNA积累降低、rRNA修饰模式改变、pre-rRNA成熟受损、翻译输出降低、增殖降低和凋亡增加。这些发现提示Δ251–254表现为功能丧失变异，并鉴定snoRNP组装因子相互作用的破坏为该变异的主要分子后果。更广泛地说，研究结果定义了ZNHIT3的特定疾病变异如何扰动细胞功能，为理解ZNHIT3相关疾病的表型变异性提供了等位基因特异性框架。需要注意的是，本研究中检查的Δ251–254变异由异位表达构建体表达，因此用于评估突变等位基因编码蛋白的功能特性；由于相应的患者来源c.251_254del变异引入提前终止密码子，内源突变转录本在体内可能受到无义介导的mRNA衰变影响，因此患者的致病机制可能涉及转录本丰度降低导致的ZNHIT3蛋白生产丧失以及逃逸转录本监视的任何突变蛋白的功能受损。一个值得注意的观察是致病性ZNHIT3变异并非均匀影响所有box C/D snoRNA，而是仅一部分snoRNA显示稳态丰度降低，表明个体snoRNA对有效ZNHIT3介导的组装的依赖性不同。重要的是，这种现象并非人类细胞模型独有；既往酵母研究表明snoRNP组装途径的破坏同样仅影响一部分box C/D snoRNA和rRNA修饰，提示对snoRNP组装缺陷的选择性敏感性是该途径的进化保守特征。携带致病性NOP58变异的患者来源成纤维细胞中也报道了对box C/D snoRNA丰度的选择性影响。因此，个体box C/D snoRNA之间的差异敏感性似乎是snoRNP生物发生相关疾病的反复特征，但其分子基础仍不清楚。box C/D snoRNA在丰度、稳定性、细胞内运输以及与蛋白质和靶RNA的相互作用方面差异很大，因此个体snoRNA可能对有效组装和成熟表现出不同的需求。研究结果支持ZNHIT3缺陷优先使易感snoRNA亚群去稳定化而非导致box C/D snoRNP全局崩溃的模型。重要的是，snoRNA的选择性丧失在某些情况下伴随可测量的rRNA修饰模式变化，证明snoRNA稳态的相对温和扰动可产生下游后果。大多数受影响修饰位点对应人类RiboMethSeq研究中先前鉴定的自然可变修饰，而28S-Gm4166通常被认为是高度稳定的修饰位点；受影响位点因此涵盖已知敏感性的范围。与芽殖酵母Hit1模型的比较揭示了在单一保守且高度稳定修饰位点的重叠，提示28S-Gm4166/25S-Gm2619的修饰对ZNHIT3/Hit1功能障碍特别敏感。rRNA修饰缺陷的选择性性质也可能对疾病发病机制具有更广泛的意义。越来越多的证据表明rRNA修饰不仅是核糖体的静态结构特征，还可影响翻译效率、保真度和对细胞需求的响应性；在此背景下，致病性ZNHIT3变异可能通过减少核糖体生产在数量上以及通过改变rRNA修饰模式在质量上影响核糖体功能。关于ZNHIT3关键发育作用的研究发现进一步得到近期条件性小鼠模型研究的支持，这些研究证明Znhit3对小脑颗粒细胞发育和核仁稳态维持至关重要。与PEHO综合征中ZNHIT3缺陷与小脑颗粒神经元丢失相关的早期观察一致，在小脑颗粒细胞谱系中条件性消融Znhit3导致颗粒细胞祖细胞存活、增殖、分化和迁移受损，导致进行性小脑发育不全和运动功能障碍；缺陷性rRNA加工和核仁应激被鉴定为Znhit3丧失的核心分子后果，进一步支持ZNHIT3在神经发育过程中核糖体生物发生中的关键作用。重要的是，这些体内观察补充了研究人员对致病性ZNHIT3变异的分子分析，并支持核糖体生物发生破坏可能是ZNHIT3缺陷的主要致病后果的结论。研究表明翻译输出不仅在表达严重Δ251–254变异的细胞中降低，而且在表达C14R的细胞中也降低，尽管该变异对pre-rRNA加工的影响相对温和。这一发现与在芽殖酵母模型中的观察一致，提示蛋白质合成对部分ZNHIT3缺陷特别敏感，并揭示snoRNP组装、rRNA修饰或核糖体组成的细微改变如何损害翻译。这些观察与核糖体病生物学中的新兴概念一致，即核糖体生物发生的相对温和扰动可通过核糖体数量和翻译能力的数量降低以及翻译的质量变化产生深远的生物学后果。

研究结论翻译：总之，本研究将PEHO综合征的临床谱扩展至包括与胎儿水肿和胎儿丢失相关的产前疾病，并提供了致病性ZNHIT3变异如何破坏细胞稳态的机制见解。研究结果支持这样一个模型：致病性ZNHIT3变异无论其潜在分子机制如何，均损害box C/D snoRNP组装、改变snoRNA稳态和rRNA修饰，并最终降低翻译输出。与近期体内证据一起，这些结果确立缺陷性核糖体生物发生和翻译是ZNHIT3相关疾病的核心致病机制。更广泛地说，本研究加强了核糖体生物发生缺陷与选择性神经发育脆弱性之间日益增长的联系，突出表明一个基本且普遍存在的细胞途径的扰动如何导致高度特异性的发育病理。