整合多数据集基因表达分析揭示结直肠癌新型离子转运生物标志物

《Genes》：Integrative Multi-Dataset Gene Expression Analysis Reveals Novel Ion Transport Biomarkers in Colorectal Cancer

　　

背景：2022年，世界卫生组织宣布结直肠癌（CRC）为全球第三大常见癌症及第二大癌症相关死亡原因。CRC进展由累积性遗传与表观遗传改变驱动，可促使良性腺瘤转变为浸润性腺癌。鉴于其死亡率及早期检测的挑战，利用公共数据集的计算分析为提示新型生物标志物及疾病潜在分子基础提供了有力途径。方法：研究人员对四个包含人类肿瘤与正常样本的CRC NCBI GEO基因表达数据集应用了整合基因表达分析方法。该模块检测四个数据集共同的上调/下调差异表达基因（DEGs）。随后，利用基因本体论（GO）和KEGG通路进行功能富集分析，以识别关键生物学过程及潜在生物标志物。然后，利用癌症基因组图谱（TCGA-COAD/READ）数据集评估核心候选生物标志物，并通过受试者工作特征（ROC）曲线和Kaplan–Meier生存分析评估其诊断与预后效用。结果：获得了一组在全部四个数据集中共同存在且通过TCGA数据集成功验证的稳健的14个下调基因和8个上调基因。值得注意的是，这14个下调基因在功能上与上皮离子和电解质转运的调控相关。结论：本研究提供了稳健的多数据集计算分析，指出上皮电解质转运减少是肿瘤样本的特征性分子改变。所识别的22个基因得到现有实验文献的支持，并被提议作为未来结直肠癌诊断的潜在诊断与预后生物标志物。

研究背景方面，结直肠癌（CRC）累及大肠上皮细胞，2022年被世界卫生组织列为全球第三大常见癌症，年诊断病例超过190万例，年死亡约90万例，居癌症相关死亡第二位。CRC通常由累积性遗传与表观遗传改变驱动，可使良性腺瘤转变为浸润性腺癌，该多步骤过程可受慢性炎症与环境暴露影响。CRC预后高度依赖诊断分期，早期患者5年生存率约为71%至90%，而转移后生存率降至约14%，凸显早期检测的重要性，但早期缺乏明显症状使检测面临挑战。近年来研究已识别驱动CRC进展的关键信号通路，包括Wnt/β-catenin、MAPK和PI3K通路；分子水平分析还揭示了癌细胞、基质细胞与细胞外基质（ECM）之间的特定相互作用，这些相互作用仅凭组织学检查难以检出。此外，结肠上皮依赖受调控的钠和氯转运以维持健康的组织功能，离子转运在CRC主要生物学过程中的重要作用已被指出，可利用靶向离子通道和离子载体的基因表达研究加以探讨。然而，肿瘤学研究的首要挑战在于将海量基因组数据集转化为临床可用知识，尽管CRC生物学理解已取得显著进展，将分子发现转化为临床发现仍存在困难；整合多组学与计算方法为弥合这一差距提供了有力框架。目前需要计算方法结合临床关注，利用先进生物信息学技术加强对CRC分子基础的发现，公共数据集特别是NCBI基因表达综合数据库（GEO）为开发和部署这些计算方法奠定了基础，例如NCBI GEO目前包含约2954个人类CRC基因表达谱系列（GSE）记录。在此背景下，研究人员开展了本项研究：对四个信息丰富的NCBI GEO基因表达数据集进行深入分析，以突出CRC关键特征并提出未来研究的潜在生物标志物，并利用癌症基因组图谱（TCGA）中结肠腺癌（TCGA-COAD）和直肠腺癌（TCGA-READ）的独立大规模转录组数据集验证所识别的基因表达模式。研究结论为：本研究对四个公共NCBI GEO数据集进行了深入分析，以识别CRC进展中的关键分子特征和潜在生物标志物；分析在考虑肿瘤与正常样本的情况下识别出2150个共同DEGs，凸显了一组可能驱动CRC发展的稳健基因；研究识别出一组持续上调/下调的DEGs，并利用TCGA COAD和READ数据集进行了验证；对这些DEGs的一般功能分析揭示了一组显著扰动的生物学过程，涉及核糖核蛋白复合物生物发生、染色体分离、细胞器分裂和核糖体生物发生，此外Wnt信号通路表现出异常行为；在所有数据集中持续下调的14个基因主要与上皮离子转运相关，包括氯跨膜转运，此外还涉及肽激素反应和酒精代谢，提示CRC中正常上皮离子转运过程的丧失；另一方面，在所有数据集中持续上调的8个基因主要参与细胞外基质组织和降解，表明ECM重塑增强，可能促进肿瘤侵袭和转移；最后，所识别的22个上调/下调基因大多通过文献湿实验研究得到验证，提示其作为CRC潜在生物标志物的稳健性，可指导新的诊断方案。本研究的重要意义在于提出上皮电解质转运减少是肿瘤样本的特征性分子改变，所识别的22个基因可作为未来CRC诊断的潜在诊断与预后生物标志物。研究方法方面，研究人员基于包含人类CRC样本、样本量足以保证统计可靠性以及具备对照或比较组织等标准，选取了四个公共NCBI GEO数据集（GSE87211、GSE20916、GSE21510、GSE9348），并获取各数据集的预归一化版本；验证数据集取自TCGA COAD和READ数据集。差异表达基因（DEGs）采用Kolmogorov–Smirnov（KS）检验识别，检验模块在Python 3.13环境中通过scipy.stats包实现，采用0.001的严格p值阈值并经错误发现率（FDR）校正（阈值0.05）以减少假阳性；随后利用受试者工作特征（ROC）曲线进行曲线下面积（AUC）分析以评估所需分析灵敏度，并计算对数倍数变化（LogFC），以|0.7|为严格阈值将DEGs归类为上调或下调；GO富集分析采用gseapy库，通路分析利用Bioservices包基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行，并计算每个通路的扰动基因百分比及倍数富集分数；采用Bioconductor包（GOSim 1.38.0、clusterProfiler 4.20.2、ggplot2 4.0.3）可视化富集GO生物学过程，利用STRING12.5数据库生成蛋白–蛋白相互作用网络，富集通路通过ShinyGo0.82和NIH DAVID检测。研究结果方面，第一，差异基因表达分析：对所选数据集考虑肿瘤与正常类别进行深入差异表达分析，报告全部数据集中共有2150个共同DEGs，如此高度的共性提示这些基因可能参与CRC发生，具备进一步分析的潜在生物学相关性和可靠性；GO与通路富集分析显示强富集行为，尤其见于核糖核蛋白复合物生物发生、细胞器分裂、染色体分离、核糖体生物发生和核分裂，许多富集GO条目与核糖体和染色体活动相关，如rRNA代谢过程、rRNA加工和姐妹染色单体分离；通路富集分析显示多个显著扰动通路，按扰动基因百分比排序最富集的为代谢通路（12.71%）、细胞周期（2.4%）、人T细胞白血病病毒1型感染（2%）、Wnt信号通路（1.70%）、辅因子生物合成（1.55%）、细胞衰老（1.5%）和p53信号通路（0.8%），此外还识别出脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢等通路，提示CRC中存在广泛的代谢和信号变异；脂肪酸降解、核苷酸糖生物合成和细胞周期等通路呈现最高倍数富集值，而代谢通路拥有最大数量的DEGs。第二，功能调控模式分析：对每个数据集的上调和下调DEGs进行标记，进一步聚焦于所有数据集共有且显示相同调控方向（持续上调或下调）的基因，以确保稳健性；维恩图显示四个数据集共有的14个下调DEGs和8个上调DEGs，这些共同基因构成后续分析的基础。第三，下调DEGs分析：全部DEGs中仅14个基因在所有数据集中均下调，即ADH1B、ANO5、CHGA、CLCA4、CLDN8、CNTN3、GCG、INSL5、MAMDC2、MS4A12、NAP1L2、SCNN1B、SI和SLC30A10，且这些基因在TCGA COAD和READ数据集中同样下调；箱线图展示所选数据集中肿瘤样本内顶级下调基因的表达行为，ROC曲线显示GCG和CHGA均达到0.98的AUC，具有高诊断准确性；GO富集网络显示细胞对肽激素刺激的反应是受下调基因影响最大的过程，其他富集过程包括伯醇代谢过程、参与免疫反应的髓系细胞活化以及氯跨膜转运，提示下调基因与激素信号、代谢调控和免疫相关过程以及上皮离子转运相关；值得注意的是，下调基因集中识别出一个独特功能簇，包括CLDN8、SCNN1B、CLCA4、SLC30A10和ANO5，该亚组基因在功能上与上皮离子转运和电解质调控相关，参与钠处理、氯转运和上皮离子通透性调节，其表达降低表明CRC的一个基本特征是结肠调节电解质能力的破坏；通路分析显示CLDN8、GCG、ADH1B、SCNN1B和ANO5参与糖酵解、糖异生、酒精性肝病和脂肪酸降解等多个重要通路，并参与内分泌调控和信号通路如胰高血糖素信号、激素信号、醛固酮调节的钠重吸收，以及紧密连接和角质化包膜形成等与上皮屏障功能相关的通路，CLDN8还与药物代谢和感染相关，GCG在胃肠道癌症中发挥作用。第四，上调DEGs分析：分析报告八个共同上调DEGs，即ACSL6、COL11A1、CXCL11、EPHX4、FOXQ1、KRT23、MMP3和MMP7，TCGA验证分析显示这八个基因在TCGA COAD和READ数据集中同样上调；箱线图可视化顶级基因在肿瘤类别中的表达升高，ROC曲线显示FOXQ1的AUC为0.983、MMP7为0.968，强化了统计显著性；GO富集分析显示最显著富集的生物学过程主要与细胞外基质结构和组织相关，最显著的条目包括外部包封结构组织、细胞外基质组织和细胞外结构组织，其中COL11A1、MMP3和MMP7是构建该网络的关键基因，提示肿瘤组织中细胞外基质活性增加，表明上调基因与对CRC进展或转移至关重要的ECM重塑强烈相关；通路分析显示MMP3和CXCL11参与炎症相关通路（如类风湿性关节炎、IL-17信号通路、细胞因子–细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路）和癌症通路（如癌症中的转录失调、膀胱癌、前列腺癌和癌症通路），MMP7和KRT23与Wnt信号通路、雌激素信号和感染反应相关，EPHX4与化学致癌相关，COL11A1与肌肉细胞细胞骨架及蛋白质消化吸收相关，ACSL6仅映射到代谢通路；利用GSE87211数据集生成的heatmap清楚地区分CRC肿瘤与正常样本，顶部14个下调基因在肿瘤样本中表达低于正常样本，下方8个上调基因在肿瘤样本中表达高于正常样本，证实所识别DEGs高度稳健。第五，TCGA基因表达与生存分析：TCGA-COAD和TCGA-READ数据集分析证实22个共同DEGs具有相同表达行为，即上调基因在TCGA数据集中上调、下调基因下调；利用GEPIA2检查22个候选基因表达与总生存的关系，GCG、CLCA4和MS4A12较低表达与较差生存相关（p < 0.05，分别为p = 0.0063、0.013和0.048），其余19个基因未达该阈值；CLCA4较低表达与较差总生存显著相关（Log-rank p = 0.013），而COL11A1较高表达显示生存概率降低趋势（Log-rank p = 0.078），但差异仅为统计学边缘性。讨论部分总结：本研究中研究人员分析了四个由正常和肿瘤组织构成的数据集，以识别与CRC进展相关的潜在生物标志物基因；分析揭示全部数据集中共有2150个共同DEGs，随后考虑所有数据集标记共同上调与下调基因，得到全部数据集共有的8个上调基因和14个下调基因，22个共同上/下调DEGs初步通过TCGA外部数据集验证，并结合深入的文献验证支持研究结果。关于共同DEGs，GO富集分析显示较高倍数富集值提示更强的通路参与，富集过程包括核糖核蛋白复合物生物发生、rRNA加工、染色体分离和姐妹染色单体分离等多个核糖体和染色体活动；近期研究指出异常rRNA加工和rRNA化学修饰产生驱动翻译朝向致癌程序的核糖体，可产生有利于肿瘤生长的蛋白质组，CRC患者中m6A和m1A等核苷水平升高影响RNA甲基化过程，提示表观转录组和转录后调控机制参与结直肠肿瘤进展；线粒体rRNA修饰可影响线粒体功能、能量产生和活性氧生成，有助于癌细胞的韧性和生长；细胞分裂中姐妹染色单体的正确分离对染色体稳定性至关重要，错误可能导致异常染色体和结构重排，促进肿瘤生长和瘤内变异；总体而言这些因素通过促进细胞增殖增加、蛋白质合成改变和基因组不稳定性与癌症进展相关。分析还揭示多个CRC进展相关通路，包括脂肪酸降解、代谢和生物合成；CRC癌细胞增强脂肪酸合成和摄取以促进分裂和生存，同时抑制脂肪酸降解以促进肿瘤细胞增殖；核苷酸糖生产与脂质合成偶联，维持CRC细胞的增殖和抗氧化需求；谷胱甘肽代谢（GSH）通路主要通过保护细胞免受氧化应激在CRC进展中发挥关键作用，GSH水平升高帮助癌细胞抵抗治疗。关于下调基因的意义，作为初始验证步骤，研究人员确认共同下调基因在TCGA COAD和READ数据集中具有相同表达行为；近期研究显示大多数结直肠癌在疾病早期ADH1B mRNA水平显著降低，且表达水平随CRC进展进一步下降；CHGA在结肠癌早期表达降低，提示其可作为早期诊断生物标志物，尽管其在原发与转移细胞系中显示表达增加；CNTN3在CRC和肠道中的作用复杂且需进一步研究，但被发现下调并标记为CRC进展的潜在生物标志物；GCG是本研究中顶级DEGs之一，与健康对照样本相比在结肠和直肠腺癌中显著下调；INSL5在CRC组织中表达低于正常组织，而较高INSL5表达与CRC患者更好预后相关；一项CRC甲基化PCR分析研究发现MAMDC2基因下调并在大部分CRC样本中显示甲基化存在；关于MS4A12，近期研究将其标记为可提高原发性CRC患者生存率的潜在生物标志物，并发现其在CRC组织与正常结直肠组织中呈显著下调差异表达；NAP1L2被发现显著下调，需进一步分析以识别其在CRC中的作用；蔗糖酶–异麦芽糖酶（SI）在人结肠腺癌Caco-2细胞中表达下调，并与生长因子活性呈负相关。关于离子转运失调的功能意义，下调基因中CLDN8、SCNN1B、CLCA4、SLC30A10和ANO5作为离子转运调控因子群体脱颖而出，它们协同维持结肠内衬健康与功能；钠通道亚基SCNN1B和CLDN8在上皮钠转运和电解质平衡中发挥作用，使用CRC细胞系的体外研究显示SCNN1B抑制细胞增殖、诱导细胞周期阻滞并抑制细胞迁移，SCNN1B可作为预测CRC进展和预后的有效分子标志物；CLDN8通过关闭细胞旁屏障防止钠泄漏，对钠吸收有直接影响，破坏组织正常液体平衡并创造有利于肿瘤生长的环境，值得注意的是CLDN8表达行为存在波动，有报道其在CRC组织中上调并通过增加增殖、迁移和侵袭及激活MAPK/ERK信号通路促进癌症，也有报道其根据特定肿瘤亚型和RNA水平背景而下调；CLCA4在CRC中下调，作为参与氯跨膜转运的抑癌基因帮助结肠细胞维持适当 rigid 结构，其表达降低与更具侵袭性的肿瘤和更差患者生存相关；ANO5属于钙激活氯通道Anoctamin家族，在正常胃肠道上皮组织中显著表达以帮助调节细胞稳态，除离子转运主要作用外，ANO5下调削弱野生型TP53转录表达，而后者对细胞损伤修复和肿瘤抑制至关重要；最后，SLC30A10作为金属离子转运体参与细胞离子稳态，其低表达促进CRC细胞增殖和迁移，使其成为治疗靶点；这些离子转运基因表达降低提示结肠保护性内衬发生根本性改变，近期空间转录组分析表明从炎症性肠病（IBD）到CRC的发展与参与矿物质吸收和上皮稳态的上皮细胞群体丢失和重编程相关，这种转变导致组织失去平衡并朝向更癌变状态。关于下调基因的功能富集验证，激素过程主要由GCG驱动，GCG被视为内分泌相关基因，在肿瘤组织中下调的基因中持续富集；包括生长抑素、CRHR2和GLP1在内的多个肽激素通路参与CRC进展的下调或抑制，主要通过抑制细胞增殖、诱导凋亡或调节对肿瘤生长至关重要的细胞过程；伯醇代谢通路可通过两个关键机制抑制CRC进展，即通过醛脱氢酶（ALDH）解毒致癌物乙醛，以及合成维甲酸这一调节细胞分化并抑制癌细胞生长的强效肿瘤抑制分子；此外，调节氯转运的跨膜氯通道囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）在CRC中频繁下调，其功能丧失与侵袭性肿瘤发展相关；肿瘤微环境中的髓系细胞活化常导致髓源性抑制细胞扩增和活化，由于CHGA的矛盾作用促进CRC进展和免疫逃逸。考虑扰动通路，CLDN8缺失与结肠上皮屏障通路破坏相关；此外，简明弯曲杆菌感染降低ENaC依赖性Na+转运并降低claudin-8表达，导致上皮屏障功能和钠吸收缺陷；CLDN8在肠道炎症中被报道下调，其在维持紧密连接结构中的重要作用已获证实，进一步损害上皮屏障；胰高血糖素（GCG）在结肠和直肠腺癌中显著下调并与患者临床结局相关，GCG富集于细胞周期和信号通路包括神经肽配体–受体相互作用和WNT相关通路，提示胰高血糖素相关信号破坏参与胃肠道肿瘤生物学。总体而言，多个下调基因与上皮离子转运和电解质调控相关，特别是CLDN8、SCNN1B、CLCA4、SLC30A10和ANO5与钠处理、氯传导或上皮离子通透性相关，这与GO分析中观察到的氯跨膜转运富集一致，支持CRC肿瘤中离子转运相关基因表达降低；通路分析进一步强化这一观察，因为CLDN8缺失与紧密连接完整性破坏和ENaC依赖性钠转运相关。关于上调基因的意义，上调基因常增强细胞增殖和其他促进癌症进展的过程；作为初始验证步骤，研究人员确认共同上调基因在TCGA COAD和READ数据集中具有相同表达行为。ACSL6是一个有趣基因，在大多数癌症类型中表达降低，但在CRC中并非如此，其在CRC中上调并被报道通过增强CRC发展降低生存率；COL11A1过表达使其成为可能有助于靶向治疗的预后生物标志物，同样常与低生存率相关，该基因影响强烈影响CRC进展的致癌基因组和代谢通路，需进一步关注；另一个重要基因CXCL11在结肠腺癌、直肠腺癌和其他结肠炎症疾病中均上调，并已被证实与其他趋化因子一起参与免疫信号、血管生成和肠道修复机制，可能促进肿瘤发展；环氧化物水解酶EPHX4在CRC中较正常样本上调，明显增强CRC恶性程度；FOXQ1在CRC中高度过表达并促进肿瘤进展，这是通过其调节涉及细胞周期控制、血管生成和凋亡抵抗的多个致癌通路的能力实现，使其成为CRC发展的关键角色；MMP3与MMP7一起被识别为关键基因，在CRC早期过表达中发挥重要作用，促进正常结肠上皮细胞向腺瘤进而向浸润性癌症发展；近期研究提示若KRT23被沉默，CRC迁移和發展可被抑制，因其在CRC中高表达并促进癌症干细胞特性，相反抑制KRT23表达显著降低体外和体内肿瘤细胞生长。关于上调基因的功能富集验证，主要富集过程被认为促进CRC进展，外部包封结构组织、细胞外基质（ECM）组织、细胞外结构组织、细胞外基质分解和胶原分解过程均相互关联促进CRC；ECM组织和胶原分解过程具有诊断、预后和治疗意义，如支持转移定植和CRC治疗失败，此外交联ECM增加间质液压力并可排除免疫细胞或损害药物递送，从而促进化疗耐药；胶原和胶原酶编码基因（如COL1A1/2）上调与较差总生存相关，并可能使患者呈现侵袭性疾病生物学；MMP3和MMP7属于能够分解细胞外基质所有基本成分的一大类蛋白酶；总之，ECM组织（结构、硬度）和ECM分解（MMP驱动的胶原分解）共同作用将肿瘤环境转变为更有利于CRC侵袭和转移的状态，这些变化也产生有用的生物标志物和潜在治疗靶点。关于扰动通路，MMP3表达随IL-17通路激活和结直肠肿瘤细胞外基质重塑而增加，支持其在细胞因子、趋化因子和IL-17介导的炎症信号中的作用；单细胞转录组比较进一步支持这一点，揭示上调的趋化因子信号和NF-κB/IL-17通路在CRC微环境中的单核–巨噬细胞内高度活跃，驱动慢性炎症反应促进细胞生长；同样，CXCL11在溃疡性结肠炎患者发生的CRC中过表达，并促进细胞因子–细胞因子受体相互作用，在CRC基因网络中与关键趋化因子信号介质聚类；此外，MMP7在功能上与Wnt/β-catenin信号通路相关，参与早期肿瘤进展并通过细胞外基质降解促进侵袭和转移；雌激素信号通路已被证明可减少MMP7激活，提示内分泌调控可能限制CRC转移。关于生存分析的局限性，研究人员在TCGA验证阶段注意到22个候选基因在肿瘤与正常组织间显示一致表达差异，然而仅三个基因在GEPIA2分析中显示统计学显著的生存差异，提示尽管所提出的基因明显与CRC进展相关，但并非所有基因都与患者生存直接相关；此外，需要更多研究包括考虑年龄和肿瘤分期等临床因素的分析，以评估其与生存的关系。