《Cyborg and Bionic Systems》：A Spatial Multiomics Atlas and Resource for Immune-Fibrotic Niches in Chronic Kidney Allograft Dysfunction
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慢性同种异体移植物功能障碍（chronic allograft dysfunction, CAD）是晚期肾移植物衰竭的主要原因，然而其空间组织的细胞和代谢机制仍因人类活检稀缺和实验模型不完善而未能得到良好解析。本研究建立了一种他克莫司（tacrolimus,
慢性同种异体移植物功能障碍（chronic allograft dysfunction, CAD）是晚期肾移植物衰竭的主要原因，然而其空间组织的细胞和代谢机制仍因人类活检稀缺和实验模型不完善而未能得到良好解析。本研究建立了一种他克莫司（tacrolimus, Tac）调节的加速性小鼠CAD模型，并通过整合小鼠单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）、流式细胞术（flow cytometry）和多重成像与人类单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）、Visium HD空间转录组学（spatial transcriptomics）及空间代谢组学（spatial metabolomics），构建了一个跨物种多组学图谱。跨物种分析揭示了保守的免疫、基质、上皮和髓系程序，并描绘了两个解剖学上不同的纤维化微环境。皮质纤维化与内皮细胞/周细胞（endothelial/pericyte）重塑、胆固醇生物合成转录程序的改变以及区域胆固醇相关信号的减少相关。髓质纤维化则富集了伴有糖酵解相关重塑的近端小管S3段细胞（proximal-tubule S3, PT(S3)），区域乳酸相关信号增加，以及邻近的组织驻留记忆T细胞（tissue-resident memory T cell, Trm）区域表现出非典型的耗竭样程序。谷氨酰胺/谷氨酸代谢相关程序伴随着推断的单核细胞向巨噬细胞状态的重塑。在肾小管上皮细胞中，2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose, 2-DG）部分减弱了转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）诱导的E-钙黏蛋白（E-cadherin）丢失和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）诱导，为糖酵解相关的肾小管重塑提供了初步的功能支持。此外，研究人员还提供了一个探索性的肾移植多组学资源平台，用于数据可视化、平台衍生结果的辅助总结以及基因/通路查询。总之，本研究提供了一个空间分辨的跨物种框架，用于识别CAD中候选的免疫-代谢机制并优先确定可实验验证的靶点。
一、研究背景与科学问题
肾移植是终末期肾病最有效的治疗手段，但长期预后受到慢性同种异体移植物功能障碍（chronic allograft dysfunction, CAD）的严重限制。CAD涉及持续的免疫性和非免疫性损伤、炎症、微血管和肾小管损伤以及进行性细胞外基质（extracellular matrix, ECM）积聚，最终可能导致移植物衰竭。尽管现有免疫抑制方案能减少急性排斥反应，但无法完全阻止晚期移植物损伤，且伴随感染、恶性肿瘤和药物毒性风险。肾间质纤维化是CAD长期预后的关键决定因素，其中肌成纤维细胞（myofibroblasts, MFBs）是主要的效应细胞，但其起源、表型异质性和调控机制尚不完全清楚。由于人类活检样本稀缺且现有动物模型不够理想，CAD中空间组织的细胞和代谢机制尚未得到良好解析。因此，研究人员旨在建立一个综合性的跨物种空间多组学图谱，以系统地鉴定CAD中保守的细胞状态、定义区域特异性的免疫纤维化微环境，并优先确定与疾病进展相关的代谢程序。
二、研究方法与技术路线
研究人员首先建立了一种他克莫司（tacrolimus, Tac）调节的加速性小鼠CAD模型，具体采用C57BL/6供体至BALB/c受体的移植组合，并结合Tac诱导与间歇维持方案。在此基础上，整合了多种关键技术方法：
- 1.
单细胞与单细胞核转录组学：对小鼠移植物进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），并对人类活检样本进行单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq），数据来源包括自行采集及公共数据库（Gene Expression Omnibus和European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute）。
- 2.
空间转录组学与代谢组学：对人类活检切片进行Visium HD空间转录组学和基质辅助激光解吸电离-质谱成像（MALDI-MSI）空间代谢组学分析，两者在相邻切片上进行以实现区域水平对应。
- 3.
多模态验证技术：结合流式细胞术（flow cytometry）和多重重叠免疫荧光（multiplex immunofluorescence）等技术，对关键细胞群和蛋白表达进行验证。
- 4.
体外功能实验：使用人肾近端小管上皮细胞系HK-2，通过TGF-β1刺激和2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose, 2-DG）干预，探究糖酵解在肾小管纤维化重塑中的作用。
- 5.
计算分析方法：运用SATURN进行跨物种数据整合，利用RNA速率（RNA velocity）、伪时间（pseudotime）和基于划分的图抽象（partition-based graph abstraction, PAGA）推断转录状态关系，并使用CellChat、CellPhoneDB预测配体-受体相互作用，通过基因集变异分析（gene set variation analysis, GSVA）和scMetabolism评估通路活性。
三、主要研究结果
1. 表征Tac调节的加速性CAD模型
通过比较同系移植（Syn）、Tac调节的同种异体移植（Allo-CAD）、未处理的慢排斥组（Allo-SR）和急性排斥组（Allo-AR），发现Allo-CAD组在术后16周内出现了进行性的移植物损伤，包括间质纤维化、肾小管萎缩和局灶性肾小球硬化，同时伴有血清肌酐和尿素氮升高，以及胶原I和纤连蛋白沉积增加。这证实该模型成功模拟了慢性同种异体移植物损伤的关键特征。
2. 跨物种鉴定慢性移植物损伤中的保守细胞状态和通路
通过SATURN整合人类和小鼠数据集，研究人员发现主要细胞类别在共享嵌入空间中呈现广泛对应关系。共享的宏观基因程序在单核吞噬细胞系统（mononuclear phagocyte system, MPS）中捕获了抗原处理和免疫功能，在T细胞中则涉及翻译、代谢、细胞骨架和调控程序。Ingenuity Pathway Analysis显示T细胞和MPS区室中存在部分保守和物种特异性的通路模式。
3. 空间和单细胞图谱鉴定ECM产生的区域特异性候选细胞贡献者
小鼠单细胞图谱显示，Allo组中基质和免疫细胞比例增加。ECM相关基因集的AUCell评分在基质细胞群中最强，在上皮和髓系细胞群中也有较低但可检测的信号。人类空间转录组学将空间bin注释为不同结构域，并在CAD活检中观察到区域性的ECM基因表达升高。多重免疫荧光显示纤连蛋白和α-SMA与内皮、周细胞、上皮和巨噬细胞标记物存在区域依赖性的共定位模式。
4. 内皮和血管周围重塑与皮质纤维化中的胆固醇相关程序变化相关
联合分析显示，Allo组中内皮细胞相对比例降低，而FB/MFB和周细胞比例升高。伪时间和RNA速率分析提示内皮细胞、周细胞和FB/MFB之间存在转录状态关系，并伴随胶原和脂质代谢基因的变化。KEGG富集和scMetabolism分析揭示了AMPK、类固醇/胆固醇相关、糖酵解和脂肪酸代谢程序的差异。人类CAD皮质区域显示FB/MFB富集域与EC富集域空间相邻，且FB/MFB为中心的ECM相关通讯增强。空间代谢组学显示CAD皮质区域中一个胆固醇相关离子信号强度降低。
5. PT(S3)富集的糖酵解相关转录重塑与CAD髓质纤维化相关
上皮细胞亚聚类鉴定出两个近端小管群体：PT(S1-2)和PT(S3)。Allo组的PT(S3)细胞显示出更高的ECM相关转录评分。RNA速率和伪时间分析将PT(S3)和FB/MFB状态置于连接的转录分支中。与PT(S1-2)相比，PT(S3)富集了糖酵解/糖异生等通路。人类髓质Visium HD数据显示PT(S3)富集bin与FB/MFB富集的ECM丰富域相邻，且糖酵解/糖异生评分升高。空间代谢组学显示CAD髓质区域中乳酸相关离子强度更高。体外实验表明，2-DG可部分逆转TGF-β1诱导的HK-2细胞中E-钙黏蛋白丢失和α-SMA诱导。
6. 组织驻留记忆T细胞在CAD中呈现耗竭样转录程序并定位于PT(S3)富集域附近
T细胞亚群分析显示，Allo组中耗竭样T细胞和组织驻留记忆T细胞（tissue-resident memory T cell, Trm）的相对比例增加。CellPhoneDB预测CD8Trm与上皮细胞之间的相互作用对数量增多。PAGA和RNA速率分析提示Trm和耗竭样T细胞（exhausted-like T cell, Tex）之间的转录关系方向发生转变。耗竭相关转录评分和检查点基因（如PDCD1、LAG3）在Tex样和Trm群体中富集。在人类CAD空间域中，PT(S3)富集、MFB富集和Trm富集bin在空间上邻近。
7. 髓系状态重塑与CAD中谷氨酰胺/谷氨酸相关转录程序相关
MPS亚聚类显示，Allo组中巨噬细胞比例降低，而单核细胞和树突状细胞比例升高。GSVA显示巨噬细胞和单核细胞区室中富集了炎症、补体和TGF-β等程序。RNA速率分析将单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞状态置于连接的转录邻域中。伪时间相关基因的KEGG富集涉及谷氨酰胺和更广泛的氨基酸代谢程序。空间代谢组学显示CAD切片中谷氨酸相关离子信号更为显著。单核细胞进一步分为Ly6c1高和低状态，并在Allo组中沿推断的转录连续体分布。
四、讨论与研究结论
本研究的讨论部分指出，该图谱的主要贡献在于提供了一个整合多种模态的图谱和一组可检验的假设，而非确立每个推断的转变或通路的因果关系。研究人员强调，Allo-CAD模型应被理解为一种在特定品系方向和免疫抑制方案下建立的Tac调节的加速性慢性移植物损伤模型，而非临床CAD的直接实验等价物。跨物种整合策略虽识别了保守程序，但无法消除队列异质性或物种特异性效应。
关于研究结论，研究人员总结道：该图谱鉴定了与慢性移植物损伤相关的保守且区域组织的细胞状态和代谢程序。糖酵解抑制实验为糖酵解在肾小管重塑中的作用提供了功能性证据，而更广泛的图谱则为检验内皮细胞/周细胞、PT(S3)、Trm和髓系假说提供了一个框架。该研究还提供了一个探索性的肾移植多组学资源，用于数据可视化和基因/通路探索。
