不同既往感染状态下奶牛乳房金黄色葡萄球菌（Staphylococcus hominis）重叠感染的细菌动力学、炎症反应与氧化应激

《Animals》：Superimposed Intramammary Infection with Staphylococcus hominis Under Different Pre-Existing Infection Conditions in Bovine Udder: Bacterial Dynamics, Inflammatory Response and Oxidative Stress

　　

微生物间的相互作用调控乳腺炎症与疾病严重程度。本研究考察了在患有慢性亚临床乳房炎的奶牛中，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus hominis，SH）重叠感染后的细菌动力学、炎症反应与氧化应激。研究人员将乳腺区（乳区）分配至不同SH剂量：COW1接种106与105 CFU/mL（各两个乳区）；COW2接种106 CFU/mL（两个乳区）及PBS对照（一个乳区）；COW3接种104与105 CFU/mL（各两个乳区）；COW4接种104 CFU/mL（两个乳区）。第0天，各乳区接受5 mL相应制剂。在攻菌前基线及接种后8天内对乳汁和临床参数进行评估与监测。结果显示，感染后乳房炎的严重程度在很大程度上取决于既往感染。单独SH表现为轻度病原体，主要在第1至3天引起短暂炎症，伴体细胞计数（SCC）和白细胞介素-6（IL-6）水平升高，但未独立造成严重组织损伤。强烈的免疫应答、丙二醛（MDA）水平升高及严重组织损伤主要由既往存在的主要乳房炎病原体驱动。尽管金黄色葡萄球菌（S. hominis）本质上为轻度病原体，但高细菌载量在共感染乳区中协同加剧氧化应激与临床乳房炎症状。

研究背景方面，重叠感染（superimposed infection）指在既有感染基础上发生的新感染，常使临床病程复杂化、增加诊治难度。在兽医学中，该概念多从细菌干扰与竞争性排斥角度探讨，理论上引入轻度或共生菌可预激局部先天免疫或与主要病原体竞争资源；小鼠模型已有初步验证显示轻度重叠感染可触发免疫应答并清除金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），但该动态在慢性奶牛乳房炎中的直接应用与效力尚缺乏研究。奶牛乳房炎多与多种微生物感染相关，慢性乳房炎形成持续的"慢性感染 niche"，表现为局部免疫改变、组织损伤及乳腺微生物生态紊乱，从而利于其他微生物定植并促成重叠性乳房内感染（intramammary infection，IMI）。非金黄色葡萄球菌（non-aureus staphylococci，NAS）历史上被视为次要病原体，其致病性存在种间差异；金黄色葡萄球菌（S. hominis）特定菌株在体外及小鼠体内被证明可抑制金黄色葡萄球菌（S. aureus）和无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）等主要病原体，但该菌株在奶牛不同既往感染状态乳区中的表现尚不清楚，持续炎症可能改变细菌竞争、共存与宿主应答。因此，本研究旨在评估不同既往感染条件下SH重叠感染相关的细菌动力学、炎症反应（体细胞与细胞因子应答）及氧化应激所致细胞损伤。

研究人员开展了什么研究：采用探索性、乳区水平的乳房内攻菌试验，采用部分分乳区设计，14个功能性乳区分配至四个SH浓度组（0、10⁴、10⁵、10⁶ CFU/mL），于第0天上午挤奶后经16G×2″无菌导管注入5 mL相应悬液，并在攻菌前基线与接种后8天监测乳汁与临床参数。结论为：感染后乳房炎严重程度高度依赖既往感染；SH单独作用为轻度病原体，仅引起短暂炎症，未独立造成严重组织损伤；强烈免疫应答、MDA升高与严重组织损伤主要由既往主要病原体驱动；高菌量SH在共感染乳区协同加剧氧化应激与临床乳房炎症状。重要意义在于提示细菌种间互作决定乳房炎严重程度，并为基于生物学手段的乳房炎管理提供依据。

关键技术方法（不超过250字）：研究于2023年11月至2024年2月在泰国清迈府2个小型奶牛场及清迈大学兽医学院教学牛舍开展，使用4头有慢性复发性亚临床乳房炎病史、处于淘汰计划的奶牛，共14个功能性乳区，经乳区随机分配实施部分分乳区攻菌；采用点滴平板法进行细菌计数，以MALDI-TOF MS进行菌种鉴定；以Fossomatic^TM FC测定乳汁SCC与乳成分；以ELISA测定IL-4与IL-6；以HPLC测定MDA；采用多重logistic回归与线性混合回归进行统计分析。

研究结果方面，总体情况：共评估14个乳区，COW2与COW4右侧乳区为既往无功能（盲）乳区，无乳汁样本，予以排除。攻菌前COW1所有乳区感染金黄色葡萄球菌（S. aureus），COW4两个乳区感染无乳链球菌（S. agalactiae），COW3一个乳区感染乳房链球菌（Streptococcus uberis）。在原有金黄色葡萄球菌（S. aureus）、乳房链球菌（S. uberis）、无乳链球菌（S. agalactiae）感染的乳区以10⁵和10⁶浓度重叠感染SH后，感染后1天SH即不可检出；相反，仅在攻菌前无细菌检出的COW3中检出极低浓度SH。临床乳房炎乳区比例在COW1（75%）、COW2（66.7%）、COW4（66.7%）较高，COW3仅25%（1/4）；COW1、COW2、COW4出现发热。原有感染菌多数在第1天仍存在；COW3左前乳区检出无乳链球菌（S. agalactiae）污染，但第10天清除；金黄色葡萄球菌（S. aureus）与无乳链球菌（S. agalactiae）感染持续至第10天仍可检出，而COW2的乳房链球菌（S. uberis）未再检出。

体温与临床表现：接种SH后所有奶牛体温升高，三头以其他细菌为主要感染的奶牛体温超过39.7 °C发热阈值；COW1与COW2表现为重度临床乳房炎，当地兽医为COW2使用退热药（第2、3期）与抗生素（第2期），COW1仅用退热药；第7至9期COW1与COW2体温超阈值时偶用抗生素或退热药；第10天（第21–22期）COW1与COW2仍发热，COW3与COW4全程体温正常。临床乳房炎表现多为轻度，仅COW1与COW2部分乳区某些期为中度；攻菌前COW1的Q3、COW2的Q2与Q3、COW4的Q3共4个乳区已有异常乳与轻度临床乳房炎；攻菌后第一周COW1的4个乳区、COW2的Q3及COW4的Q1与Q3多表现临床乳房炎体征。所有奶牛接种SH后体温较接种前显著升高，但退热药与抗生素给药无影响；临床乳房炎发生率随细菌浓度升高而增加，COW1与COW2临床乳房炎风险高于COW3与COW4。

细菌载量：实验性SH感染随后在几乎所有乳区消失；最严重的COW1所有乳区均存在重叠感染（超过1种细菌），主要为金黄色葡萄球菌（S. aureus），浓度超过100 CFU/mL感染阈值，且这些乳区革兰阴性菌重叠感染引起临床乳房炎。COW2重叠感染程度较轻，原感染乳房链球菌（S. uberis）并临床乳房炎数日的Q3（左后）出现低菌量金黄色葡萄球菌（S. aureus）数次升高。COW3临床乳房炎乳区最少，多为次要病原体凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci，CNS）感染，仅数次超过阈值。COW4的Q1感染无乳链球菌（S. agalactiae），Q3部分链球菌升高超过阈值，Q1尤明显。最大细菌计数显示COW1持续高于感染阈值，而COW2、COW3、COW4在若干采样期低于阈值；乳区水平上COW1所有乳区细菌计数高于其他三头牛。最终模型显示奶牛与SH-IMI浓度组与细菌计数显著相关，IMI时相效应呈边缘差异（p = 0.07），退热药与抗生素给药无影响；总体上SH-IMI后细菌计数显著升高，COW1显著高于COW2与COW4；校正奶牛与时间因素后，10⁵组最高且显著高于0与10⁶组。

体细胞计数（SCC）：以200 × 10³ cells/mL为亚临床乳房炎阈值，COW1所有乳区所有时点均定义为乳房炎（亚临床或临床）；COW2的Q2与Q3所有时点均为乳房炎；COW3 SCC升至亚临床水平，但研究后半段仅2个乳区维持亚临床乳房炎；COW4除1份样本外，Q1与Q3原感染无乳链球菌（S. agalactiae）并致临床乳房炎，但临床乳房炎乳样SCC数据无法获取，Q2多数时段SCC低于亚临床水平。将临床乳房炎不可测SCC设为9999 × 10³ cells/mL后计算，COW1全部乳区及COW2的Q2、Q3平均SCC高，COW3与COW4全部乳区低。最终模型显示除退热药与抗生素给药外多数变量与SCC显著相关；SH-IMI后第1–3天平均SCC显著升高，第4–10天下降（p < 0.01）；COW3最低，COW1与COW2最高且显著高于COW3与COW4；PBS组（0组）显著低于其他三组。

MDA、IL-4与IL-6：SH-IMI后前3天，COW1（重叠感染、较高细菌计数、较高SCC及金黄色葡萄球菌S. aureus）MDA水平高于其他奶牛，提示病情更重；COW2的Q3（左后）MDA高于同牛其他乳区，COW3与COW4无差异。IL-4高水平见于COW2，其次COW1，范围14–258 pg/mL，而COW3与COW4极低（13.6–15.8 pg/mL）；COW2所有乳区IL-4首次即高于145 pg/mL，并在随后至少3个采样期保持高于110 pg/mL。COW1的Q2（右前）早期无临床症状与较高IL-6水平并存；IL-6峰值亦见于COW2的Q1与COW3的Q3，所有峰值均出现在SH-IMI后24–36 h。按乳区平均，COW1各乳区MDA明显高于其他牛；各牛全部乳区IL-4平均值相近，COW2最高，依次为COW1、COW4、COW3；IL-6在同牛不同乳区间存在差异，COW1的Q1、Q2、Q4最低。最终模型显示退热药或抗生素给药对MDA、IL-4、IL-6均无显著影响；奶牛因素与SH-IMI浓度与MDA显著相关，COW1显著较高，COW3与COW4显著低于COW1与COW2；SH-IMI浓度呈不一致性，10⁵组高于其他组甚至高于10⁶组（p < 0.05）；奶牛因素是唯一与IL-4浓度相关的因素；IL-6未发现显著影响因素。

讨论部分总结：研究结果表明，SH-IMI后乳房炎严重程度差异显著，受奶牛个体因素与既往持续感染影响；SH-IMI后表现为短期炎症，尤其在第1–3天，伴SCC与IL-6升高，可能与乳房内细菌载量相关。在金黄色葡萄球菌（S. aureus）、无乳链球菌（S. agalactiae）、乳房链球菌（S. uberis）等主要病原体既往感染环境中未观察到SH定植，而仅在攻菌前无任何微生物的COW3检出低水平SH，支持慢性感染乳区在微生物学与免疫学上已是被占据的"niche"，阻碍新引入微生物建立或导致其快速清除；主要病原体既往感染可占据黏附位点、利用营养生态位并维持炎症状态升高SCC、预激先天防御，限制SH持续存在，且SH定植时间短于表皮葡萄球菌（S. chromogenes）或模仿葡萄球菌（S. simulans）。SH重叠感染伴随明显发热与临床表现，尤其在既往感染牛中；既往病原体持续存在已造成组织损伤与炎性细胞聚集，形成预激炎症状态，即使SH已被清除，残留细菌细胞壁成分如肽聚糖或脂磷壁酸仍可持续刺激先天免疫应答，导致炎症介质持续产生并加重临床体征或体温升高；而在未感染牛中SH建立极少、临床症状明显较轻，符合CNS多引起轻度、短暂或亚临床IMI的一般规律。临床表现取决于乳房内细菌载量，较高载量引起更强病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）应答，刺激细胞因子等炎症介质释放，导致更严重临床表现；COW1乳房炎最重，存在多种感染，主要为金黄色葡萄球菌（S. aureus），并伴革兰阴性菌重叠感染，后者脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）结合Toll样受体4（TLR4）激活强烈免疫应答，刺激趋化因子（如IL-8）与促炎细胞因子（如IL-6、IL-1β）表达，在此类既往感染条件下重叠感染可能作为炎症放大因素。10⁵组细菌计数最高且显著高于0与10⁶组属意外发现，因10⁵是唯一同时给予COW1与COW3的浓度，而10⁶给予COW1与COW2，故可能反映奶牛间及其基线感染状态差异而非接种浓度的内在非线性效应，奶牛与饲养地点亦可能影响结果。SCC方面，研究人员将临床乳房炎不可测SCC设为9999 × 10³ cells/mL，指出该替代方法可能使组均值膨胀并扭曲标准误，SCC结果应用需谨慎；SCC水平与细菌计数结果一致，COW1全部乳区持续升高的SCC与细菌计数提示金黄色葡萄球菌（S. aureus）持续感染所致慢性炎症，其可逃避宿主免疫、形成生物膜、表达超抗原并产生α-溶血素与γ-溶血素等毒素，其肽聚糖与脂磷壁酸作为PAMP被乳腺上皮细胞与局部免疫细胞表面TLR识别，导致TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎细胞因子持续产生与白细胞持续募集；COW2两个乳区SCC全程超过亚临床阈值提示乳房链球菌（S. uberis）持续炎症，其透明质酸酶与肽酶为致严重炎症的关键毒力因子，并可诱导以IL-6、IL-8高产生为特征的持续炎症反应；COW3在SH-IMI后SCC暂时升高至亚临床水平，提示SH引起的炎症反应低于主要病原体，与SH为低炎症病原体、常自行消退且对乳腺组织损伤轻微的认识一致，表明乳腺局部免疫可有效控制该感染；COW4的SCC主要受既往无乳链球菌（S. agalactiae）感染影响，其荚膜唾液酸多糖可模拟宿主细胞表面以逃避补体识别，并产生超氧化物歧化酶与C5a肽酶减少白细胞募集，导致以巨噬细胞参与先天免疫为主的较轻炎症反应，从而在不过度炎症的情况下建立伴中等SCC的慢性感染。MDA作为氧化应激与细胞损伤的主要生物标志物，COW1平均MDA最高提示持续氧化应激与更广泛不可逆乳腺组织损伤，可能源于既往金黄色葡萄球菌（S. aureus）慢性炎症状态而非单纯实验性SH-IMI；COW2乳房链球菌（S. uberis）感染乳区MDA亦高，提示白细胞浸润与慢性炎症所致乳腺上皮进行性损伤。IL-6为主要促炎细胞因子与乳房感染早期标志物，IL-4为调节免疫应答并促进组织修复的调节性细胞因子；COW1与COW2的IL-4与IL-6均升高，提示强烈细菌感染时炎症与调节通路同时发生；COW1三个乳区IL-6平均最低，可用免疫耐受解释，即慢性状态下白细胞功能受损或炎症信号通路下调影响促炎介质释放；各牛全部乳区IL-4水平相近，COW2最高、依次COW1、COW4、COW3，提示免疫调节变异为个体特异性而非SH-IMI直接效应，与IL-4应答较IL-6等促炎细胞因子更稳定（动态性更低）的报道一致。IL-4与IL-6水平与SH-IMI时相相关，第1–3天显著高于之前，支持其作为细菌感染后应答标志物的作用；这些参数同时受奶牛个体因素与SH-IMI攻菌浓度显著影响，提示氧化应激不仅取决于实验感染，也取决于个体动物的基础生理与感染状态；10⁵组MDA高于10⁶组可能归因于个体奶牛效应、细菌建立差异或宿主免疫应答变异，而非简单的剂量依赖关系，实验性乳房炎模型中细菌剂量与炎症标志物间类似的非线性关系已有报道，即中等细菌负荷可能更成功地建立感染而避免被强免疫应答立即清除。MDA与细胞因子分析表明SH-IMI诱导以IL-6短期升高为特征的短暂急性炎症反应，而MDA反映较长期氧化应激与组织损伤，且强烈受个体奶牛既往感染状态影响；COW1持续升高的MDA与受抑的IL-6应答支持慢性金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染改变乳腺免疫功能并导致持续氧化损伤的假设，因此COW1与COW2显著升高的MDA很可能归因于既往主要病原体（金黄色葡萄球菌S. aureus与乳房链球菌S. uberis）的深刻混杂效应而非单纯SH-IMI剂量；相反COW3与COW4极小的氧化应激表明高菌量SH并不独立造成严重乳腺组织损伤；因此个体奶牛因素尤其是其既往感染状态是所观察MDA与IL-6浓度差异的主要驱动因素，而IL-4全程相对稳定，提示其在本研究各牛炎症反应区分中作用有限。研究局限性包括：纳入奶牛数量少，所有动物均有既往乳房内感染及抗生素与抗炎治疗史；本研究主要为体内概念验证以阐明细菌干扰与先天免疫预激机制，为探索性研究，并非旨在建立剂量–反应关系；攻菌前对MDA、IL-4、IL-6仅依赖每乳区单次基线测量，无法反映乳汁细胞因子与氧化应激标志物的乳区内日间变异，解读攻菌后应答幅度时应予考虑；接种浓度在奶牛间分布不均、乳区产奶量、乳成分以及既往乳房内感染与饲养地点差异，导致接种浓度与奶牛水平特征间存在潜在混杂；今后应纳入更多动物与更可控的实验条件，如选择既往感染相似、感染菌株可比、治疗史标准化的奶牛，攻菌后最初24 h内更频繁采样，使用多株SH，并采用全基因组测序或菌株分型等分子方法区分真正的新引入微生物重叠感染与低丰度既往菌群增殖；面向牧场应用的转化研究应聚焦分离SH特定生物活性成分，如纯化细菌素或后生元免疫调节剂，以开发安全、非活菌的治疗制剂。

研究结论翻译：SH-IMI与体温升高及临床体征相关，但应答程度因奶牛与时期而异。高剂量SH-IMI暴露增强免疫刺激，导致乳腺内细胞因子产生与氧化应激增加。尽管金黄色葡萄球菌（S. hominis）常被认为致病性低于主要乳房炎病原体，本研究结果表明高细菌载量仍可诱导显著的炎症与氧化应答，可能促成乳腺组织损伤与乳房炎临床表现。