Mitragyna speciosa叶粉与酿酒酵母组合及单一添加对泰国本土肉牛瘤胃微生态、养分消化与微生物蛋白合成的影响

《Animals》：Effects of Dietary Hemp Harvest Residue Mixture on Carcass Characteristics, Meat Quality, and Muscle Amino Acid and Fatty Acid Profiles of Hu Ram Lambs

　　

本研究评估了Mitragyna speciosa叶粉（MSP）和酿酒酵母（SC）添加对泰国本土肉牛养分采食量及消化率、瘤胃发酵（rumen fermentation）、微生物菌群及微生物蛋白合成（microbial protein synthesis）的影响。四头雌性泰国本土肉牛（试验初始体重130.0 ± 7.4 kg）采用4 × 4拉丁方设计（Latin square design）随机分配至四种日粮处理：（T1）单独饲喂全混合日粮（total mixed ration, TMR，对照）；（T2）TMR + MSP 10 g/头/天；（T3）TMR + SC 10 g/头/天；以及（T4）TMR + MSP 5 g/头/天 + SC 5 g/头/天。试验共四个周期，每周期21天，含14%粗蛋白（crude protein, CP）的全混合日粮自由采食（ad libitum）。各组总干物质（dry matter, DM）采食量及养分采食量无显著差异（p > 0.05），尽管对照与添加处理组间的计划对比显示对照组干物质采食量存在少量不足（p = 0.041）。添加组的干物质、有机质（organic matter, OM）、粗蛋白和酸性洗涤纤维（acid detergent fiber, ADF）全肠道表观消化率均高于对照组（p < 0.05），中性洗涤纤维（neutral detergent fiber, NDF）消化率呈上升趋势（p = 0.052）。瘤胃pH升高，含SC的两个处理组尤为显著（p = 0.001），而瘤胃氨态氮（ruminal ammonia nitrogen, NH₃-N）和血液尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）随添加而降低（p < 0.05）。总挥发性脂肪酸（volatile fatty acids, VFA）浓度无变化，但丙酸（propionate）比例升高且估计甲烷（methane）产量降低（p < 0.05）。添加组总细菌数增加而原虫（protozoa）数减少（p < 0.05），真菌（fungal）数则无变化。尿嘌呤衍生物（purine derivatives, PD）排泄量与吸收量增加，微生物氮供给量（microbial nitrogen supply, MN）从24.66 g N/d升至34.21–35.93 g N/d（p = 0.002）。微生物氮供给效率（efficiency of microbial nitrogen supply, EMNS）从15.44 g N/kg瘤胃降解有机物（organic matter digested in the rumen, OMDR）升至19.30–20.07 g N/kg（p = 0.007）。因此，无论单独使用还是以各5 g组合使用，MSP和SC均能增强泰国本土肉牛的养分消化率和瘤胃发酵效率，且不影响采食量。

在东南亚小holder肉牛养殖体系中，本地品种肉牛因能够利用稻秸秆和木薯加工废料等农作物副产物而备受重视，但这些低质量、高纤维饲料在瘤胃中的降解效率低下，限制了微生物蛋白供给，并将大量能量以甲烷形式损失。随着诸多国家禁止或严格限制饲用抗生素的使用，开发可调控瘤胃环境的天然饲料添加剂成为研究热点。植物次级化合物（plant secondary compounds, PSCs）和直接饲喂微生物（direct-fed microbials, DFMs）因具有选择性抗菌、抑制原虫和产甲烷菌及稳定瘤胃pH的潜力而受到关注。其中，Mitragyna speciosa（kratom）叶富含生物碱、酚类化合物和黄酮类成分，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae, SC）则是最常用的酵母类DFM，能够消耗氧气、刺激产纤维素细菌和乳酸利用细菌生长。尽管这两类添加剂作用机制不同且具有潜在的互补性，但关于其在肉牛中的组合应用研究仍十分有限。因此，研究人员旨在评估MSP和SC单独或组合添加对泰国本土肉牛采食量、养分消化率、瘤胃发酵特性、微生物菌群及微生物蛋白合成的影响。

研究人员开展了一项4 × 4拉丁方饲养试验，以4头12月龄雌性泰国本土肉牛（初始体重130.0 ± 7.4 kg）为研究对象。研究设置四个处理：对照组（仅饲喂全混合日粮）、MSP单独添加（10 g/头/天）、SC单独添加（10 g/头/天）及二者组合添加（各5 g/头/天）。结果表明，在维持正常采食量的前提下，MSP和SC显著提高了干物质、有机质、粗蛋白和酸性洗涤纤维的全肠道表观消化率，改善了瘤胃发酵模式，显著提升了微生物氮供给量及其利用效率。这些发现为热带小型holder肉牛养殖体系中天然饲料添加剂的应用提供了理论依据。

本研究选用4头12月龄雌性泰国本土肉牛（初始体重130.0 ± 7.4 kg），采用4 × 4拉丁方设计，设置4个日粮处理。全混合日粮由稻秸秆、木薯梢和木薯皮青贮（各占干物质20%）以及木薯片、豆粕、银合欢叶粉等组成，含14.0%粗蛋白，自由采食。试验分4个周期，每周期21天（14天适应期与7天采样期）。研究人员利用酸不溶性灰分（acid-insoluble ash, AIA）内源标记法测定养分表观消化率；经瘤胃导管采集瘤胃液，测定pH、挥发性脂肪酸（volatile fatty acids, VFA）和氨态氮（NH₃-N）；采集血样测定血液尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）；通过直接计数法测定瘤胃细菌、原虫和真菌数量；利用单次Spot尿样测定尿嘌呤衍生物（purine derivatives, PD）和肌酐，估算微生物蛋白合成。所有数据采用GLM程序分析。

3.1 日粮化学组成
全混合日粮含56.5%干物质，干物质基础下含88.7%有机质、14.3%粗蛋白、58.6%中性洗涤纤维和35.2%酸性洗涤纤维。MSP含91.3%干物质，干物质基础下含19.5%粗蛋白、51.4%中性洗涤纤维和15.3%缩合单宁，属于中高蛋白、高纤维且富含缩合单宁的植物材料。

3.2 饲料与养分采食量
各组总采食量（鲜重、干物质及体重百分比）及有机质、粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维采食量差异均不显著（p > 0.05）。尽管计划对比显示对照组干物质采食量较添加组低0.15–0.23 kg/天（p = 0.041），且体重百分比采食量和粗蛋白采食量在计划对比中亦呈边缘差异（p = 0.028和0.027），但表明各处理未对适口性或采食量产生抑制效应。

3.3 养分消化率
与对照组相比，添加组的干物质、有机质、粗蛋白和酸性洗涤纤维全肠道表观消化率均显著提高（p ≤ 0.040），中性洗涤纤维消化率呈上升趋势（p = 0.052）。计划对比显示所有养分指标在对照组与添加组间差异显著（p ≤ 0.011），但三个添加处理组间经Tukey's HSD检验无显著差异，仅组合处理（T4）的粗蛋白消化率略低于两种单一添加平均值（63.77%对64.85%，p = 0.049）。

3.4 瘤胃发酵特性与血液尿素氮
瘤胃pH在对照组为6.48，MSP单独添加组为6.60，而含SC的两个处理组显著升高至6.80–6.83（p = 0.001），且MSP与SC处理间差异显著（p = 0.007）。瘤胃氨态氮从对照组的16.65 mg/dL降至添加组的12.08–13.10 mg/dL（p < 0.001），血液尿素氮从14.50 mg/dL降至11.75–12.90 mg/dL（p = 0.023）。总挥发性脂肪酸浓度无显著变化（p = 0.957），但丙酸比例从19.88 mol/100 mol升高至21.93–22.28 mol/100 mol（p = 0.001），乙酸/丙酸比值下降（p < 0.001），估计甲烷产量从29.90降至28.25–28.42 mol/100 mol（p = 0.001）。

3.5 瘤胃微生物菌群
添加组的总细菌数从对照组的2.40 × 10⁹ cells/mL显著增加至3.60–4.45 × 10⁹ cells/mL（p = 0.009），而原虫数从5.60 × 10⁶ cells/mL显著降至2.20–2.70 × 10⁶ cells/mL（p = 0.002），真菌游动孢子数在各处理间无显著差异（p = 0.790）。

3.6 微生物蛋白合成
尿嘌呤衍生物总排泄量从44.58 mmol/d增加至55.63–57.69 mmol/d（p = 0.002），吸收量相应从33.92 mmol/d增至47.05–49.43 mmol/d（p = 0.002）。微生物氮供给量从24.66 g N/d显著提高至34.21–35.93 g N/d，增幅为38.7–45.7%（p = 0.002），相当于微生物粗蛋白供给量从154.1 g/d增至213.8–224.6 g/d。瘤胃降解有机物从1.60 kg/d增至1.73–1.79 kg/d（p = 0.008）。微生物氮供给效率从15.44 g N/kg OMDR提高至19.30–20.07 g N/kg OMDR，增幅为25.0–30.0%（p = 0.007）。所有微生物蛋白指标在对照组与添加组间均差异显著，而各添加处理组间无显著差异。

研究人员在讨论中指出，本研究中各处理未降低采食量，说明MSP在低剂量下未引起适口性问题。养分消化率的提升与瘤胃细菌数量增加和原虫数量减少相吻合，提示存在部分驱原虫效应（defaunation effect）。然而，MSP的缩合单宁摄入量极低，仅相当于干物质采食量的0.033%，远低于常规抑制原虫的1–4%日粮干物质剂量，因此缩合单宁并非主要驱动因素。研究推测，MSP中的吲哚类生物碱（如mitragynine和7-hydroxymitragynine）以及高含量的黄酮类和总酚类化合物可能在极低剂量下发挥药效，但尚待通过测定实际饲喂叶片中的生物碱和总酚含量来验证。值得注意的是，不含植物次级化合物的SC单独处理（T3）也产生了与MSP处理相似的消化率、原虫和微生物蛋白反应，且瘤胃pH较MSP单独处理更高，表明两种添加剂可能通过不同路径收敛于同一限制因子，即木薯和尿素型基础日粮所造成的瘤胃pH和氮同步性限制。

关于瘤胃pH升高，研究人员认为SC可通过与产乳酸细菌竞争可溶性糖、刺激乳酸利用菌（如Megasphaera elsdenii和Selenomonas ruminantium）来降低餐后酸负荷，从而有利于纤维消化，但单点pH测定无法反映全天瘤胃pH动态。瘤胃氨态氮和血液尿素氮的同步下降表明瘤胃氮捕获效率提升；原虫数量减少降低了瘤胃内蛋白质向氨的再循环，更庞大的细菌群体和更多可利用有机物为氨同化提供了更大的氮汇。由于采用单次Spot尿样和肌酐估算法，绝对嘌呤衍生物值应视为上限估计，但敏感性分析显示，即使改变肌酐排泄系数±20%或改变瘤胃降解比例假设（0.55–0.75），处理间排序和显著性均保持不变。

关于组合处理（T4），其反应与任一单一添加（10 g/天）在统计学上无法区分，但由于试验并非完全析因设计（缺少5 g单一添加组），无法得出等效性或剂量节省的结论，该发现仅作为待验证假设。此外，kratom叶含有阿片受体激动剂mitragynine和7-hydroxymitragynine，目前尚无反刍动物可食组织中这些物质或其代谢物的残留数据、停药期或最大残留限量。尽管在整个试验期间未观察到异常临床症状，且短期耐受性良好，但这仅是短期耐受的证据，不能说明长期安全性，更不能等同于组织无残留。因此，在正式完成组织残留研究和停药期评估之前，尚不支持在肉牛生产中商业化应用。

综上所述，在泰国本土肉牛日粮中添加Mitragyna speciosa叶粉（10 g/头/天）、酿酒酵母（10 g/头/天）或二者组合（各5 g/头/天），可提高干物质、有机质、粗蛋白和酸性洗涤纤维的全肠道表观消化率，并呈提高中性洗涤纤维消化率的趋势，且不影响采食量。添加处理提高了瘤胃pH（含酵母处理组尤为显著），降低了瘤胃氨态氮和血液尿素氮，增加了细菌群体并抑制了原虫，使发酵向丙酸方向偏移，降低了估计甲烷产量，并使微生物氮供给量增加38.7–45.7%。日粮氮转化为微生物蛋白的效率提高了25.0–30.0%（p = 0.007）。半剂量组合处理产生的反应与任一添加剂全剂量单一添加的反应在统计学上无法区分。然而，由于试验设计并非完全析因且残余自由度有限，该结果仅作为待验证假设，而非等效性或剂量节省效应的证据。研究人员建议在更长周期的研究中纳入生长性能测定、甲烷直接测定、瘤胃微生物组的分子表征以及组织残留分析。