日本落叶松LKF3H2基因在拟南芥中过表达促进植株生长并增强对松材线虫的抗性

《Forests》：Overexpression of LKF3H2 from Larix kaempferi Promotes Growth and Confers Resistance to Bursaphelenchus xylophilus in Arabidopsis

　　

由松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）引起的松材线虫病（PWD）对全球针叶林构成严重威胁，而传统防治措施仍然有限。因此，从日本落叶松（Larix kaempferi）等抗性树种中鉴定抗性基因对于开发保护森林的遗传策略至关重要。将来自日本落叶松的LKF3H2在拟南芥（A. thaliana）中过表达（LKF3H2-OE），显著增强了植株生长及对松材线虫的抗性。与野生型（WT）植株相比，LKF3H2-OE转基因株系株高增加61.4%，单株角果数增加61.5%，抽薹和开花分别提前6 d和5 d。接种线虫后，转基因植株发病率為40%，显著低于野生型植株（76%）。这种增强的抗性与LKF3H2表达的密度依赖性和时间依赖性诱导相关，在高接种压力下达到2.04倍，接种后7 d达到5.48倍。此外，转基因植株积累了更高水平的防御相关代谢物，包括黄酮类化合物（最高达3.12 mg/g）和脯氨酸（最高达34.35 mg/g）。这些结果表明，LKF3H2通过协同增强生长性状和激活抗病代谢途径显著提高线虫抗性，凸显其作为培育抗病木本植物关键遗传资源的潜力。

松材线虫病（PWD）由松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）引起，是一种毁灭性的全球森林病害，自北美起源地扩散以来已在亚洲和欧洲造成松树大面积死亡，带来显著的生态和经济损失。该病害具有高度隐蔽性、传播迅速且检测滞后等特点，致使传统防治措施基本无效。目前，线虫的致病机制与寄主植物的抗性机制均尚在研究之中，实现该病害的根本性控制面临重大挑战。面对这些挑战，研究人员将目光转向植物自身的内在抗性机制。松科（Pinaceae）内不同物种对松材线虫的抗性存在显著差异，因此，从抗性树种中挖掘关键抗性基因并阐明其功能已成为抗性育种的基础策略。在植物所采用的多种防御机制中，次生代谢物的积累构成重要的化学屏障。近年来，参与植物次生代谢的基因已被公认为抗病研究的重要靶标。黄酮类化合物作为一类主要的次生代谢物，在植物对生物和非生物胁迫的响应中发挥多方面作用，包括直接的抗菌和抗氧化活性以及作为防御信号分子。黄酮类3′-羟化酶（F3′H）是黄酮类生物合成途径中的关键酶，催化黄烷酮转化为高价值黄酮类化合物，但其在树木抗线虫病原体中的具体作用尚不清楚。近年来，松树响应松材线虫（PWN）胁迫的次生代谢防御机制在多个松属物种中得到进一步验证。研究表明，在马尾松（Pinus massoniana）中，接种PWN后高抗种质的α-亚麻酸代谢途径显著激活，乙醇脱氢酶基因（PmADH12和PmADH13）上调，催化下游产物(Z)-3-己烯醇的积累，体外试验进一步证实该化合物直接抑制PWN活性。黄酮代谢的防御功能也得到进一步阐明：Zhang等对西伯利亚红松（Pinus sibirica）的转录组-代谢组联合分析显示，接种线虫后查尔酮合酶（chs）和查尔酮异构酶（chi）基因显著上调，促进柚皮素、松属素和芹菜素的积累以抵抗感染。进一步证实外源海藻酸钠可通过激活chs基因和调节根皮素和高圣草酚等黄酮代谢物水平延缓蒙古松（Pinus sylvestris var. mongolica）PWD的进程。在激素调控层面，研究发现外源茉莉酸甲酯剂量依赖性降低感病意大利松（Pinus pinea）的线虫负荷并诱萜类合酶基因（AFS）上调，而抗性树在处理后JA-Ile水平显著升高，感病树则缺乏有效的激素重编程。近年来，松树-PWN相互作用的分子机制在生理响应和转录调控层面均取得进展。在分子层面，对日本落叶松接种后6 h至35 d的时间序列转录组分析揭示了防御策略的阶段依赖性转变：早期激活MAPK信号、植物激素信号转导和内质网蛋白加工；中期富集苯丙烷和萜类骨架生物合成；晚期代谢转向谷胱甘肽和脂质代谢以缓解氧化损伤。WGCNA鉴定出20个参与抗性相关代谢物生物合成、蛋白稳态和信号调控的核心基因。进一步鉴定出8515个差异表达基因（涉及几丁质酶信号、钙介导免疫和抗菌化合物生物合成）和389个防御相关代谢物，并整合为71条协同调控途径，包括ROS爆发和MAPK途径。尽管直接从松属物种鉴定抗性基因至关重要，但松树功能研究受若干技术瓶颈制约。日本落叶松的组织培养技术尚不成熟，且落叶松基因组数据集庞大。其长生命周期和遗传转化困难等限制促使研究人员采用模式植物拟南芥（A. thaliana）作为异源功能验证的有效系统。研究表明，松材线虫可成功感染拟南芥，诱导与松树类似的早期症状。异源表达已在拟南芥中用于表征多个松树抗性基因。这些发现共同强调，功能性抗性基因的存在与否是寄主结局的关键决定因素。在此研究背景下，本研究聚焦于一个来源于日本落叶松的此前未被表征的基因。由于日本落叶松对PWD表现出一定耐受性，其拥有宝贵的抗性遗传资源。在前期工作中，研究人员对健康和PWN感染的落叶松样本进行了比较代谢组分析，以鉴定抗性相关代谢途径和关键代谢物。筛选出高度上调且与抗性相关的代谢物，并结合本实验室此前获得的转录组数据，鉴定了与这些代谢物相关的基因。最终选定LkF3H2基因，因其与日本落叶松黄酮生物合成密切相关，且代谢组分析发现黄酮类化合物高度上调。LKF3H2为新近克隆的基因，属于2-OGD家族，与参与烟草黄酮生物合成的F3′H同源。然而，LKF3H2在调控植物生长发育中的精确功能，尤其是其在赋予PWN抗性中的作用和机制，仍完全未知。为填补这一知识空白，研究人员通过遗传转化将日本落叶松LKF3H2基因在拟南芥中异源过表达，以探究其潜在的双重功能。研究旨在检验以下假设：LKF3H2不仅调节植物生长发育，还通过上调黄酮类等防御代谢物的积累增强对PWN的抗性。为此，研究人员系统评估了转基因植株的关键生长性状（株高、抽薹时间、开花时间和单株角果数）和病害相关表型（发病率和症状严重度），监测了LKF3H2响应线虫感染的表达模式，并量化了黄酮类和脯氨酸等关键防御代谢物的动态积累。本研究旨在为解析树木抗性分子机制和指导抗PWD分子育种策略提供新的遗传资源和理论基础。

研究方法方面，研究人员首先基于前期转录组数据筛选与黄酮代谢途径相关的关键基因，通过NCBI数据库Blast比对确定基因类型；以4年生日本落叶松茎段为材料提取总RNA并合成cDNA，设计特异性引物克隆LKF3H2基因CDS序列并构建pUCm-T重组载体。随后通过热激法转化农杆菌（Agrobacterium tumefaciens），采用花序浸蘸法转化野生型拟南芥，经抗生素筛选和PCR鉴定获得阳性T1代植株，并繁育至T3代纯合株系用于后续实验。松材线虫由辽宁省抚顺市大伙房实验林场提供，实验室以灰葡萄孢（Botrytis cinerea）培养。以叶柄针刺法接种不同密度线虫（60、80、100、200或400条/株），接种后15 d观察表型并统计发病率。选取转基因和野生型植株各5株测定株高、单株角果数、抽薹和开花时间。于不同接种密度和不同时间点采集叶片，测定黄酮类和脯氨酸含量。选取3株转基因和3株野生型植株接种200条线虫，于不同时间点采集叶片提取总RNA并反转录为cDNA，以18S rRNA基因为内参，采用qRT-PCR定量LKF3H2相对表达水平，qPCR引物经TBtools-II的Batch qPCR Primer Design（Primer3）模块基于mRNA（CDS）序列设计。数据采用SPSS Statistics 26.0进行统计分析，GraphPad Prism 9.1进行可视化。

研究结果方面，3.1 LKF3H2过表达促进拟南芥生长发育：以野生型（WT）为对照，评估LKF3H2-OE转基因株系的株高、抽薹时间、开花时间和单株角果数等关键表型性状。播种后50 d（DAS），LKF3H2-OE植株平均株高23.88 cm，显著超过WT的14.80 cm；转基因株系25 DAS抽薹（主茎达1 cm），比WT（31 DAS）早6 d；LKF3H2-OE植株34 DAS开花（以第一朵花开放计），比WT（39 DAS）早5 d；45 DAS满果期转基因单株角果数平均21个，显著高于WT的13个。这些结果表明日本落叶松LKF3H2基因异源表达提高了拟南芥的生长和发育速率。3.2 LKF3H2过表达增强拟南芥对松材线虫的抗性：以不同密度线虫接种转基因和WT植株并监测表型变化，结果显示两种植株病害症状均随接种量增加而加重，但转基因株系症状显著轻于WT；转基因植株发病率為40%，而WT为76%，表明LKF3H2-OE株系抗性显著增强。为评估LKF3H2对线虫挑战的响应性，测定了不同线虫密度接种后7 d的表达水平（以水接种为对照），结果显示接种植株LKF3H2表达持续上调且与线虫密度正相关，对照组相对表达量设为1.36，接种60、80、100和200条线虫的表达量分别比对照高1.24、1.28、1.44和2.04倍，最高接种密度诱导显著上调，表明线虫感染对LKF3H2表达具有剂量依赖性正调控效应。时间进程实验显示，接种后1、4、7和10 d表达量分别比对照高5.6、5.46、5.48和6.69倍，表明LKF3H2在响应松材线虫感染中发挥关键作用，其持续上调表明参与植物防御机制。3.3 LKF3H2通过上调防御代谢物赋予线虫抗性：为探究LKF3H2基因对拟南芥防御相关代谢物积累的调控功能，测定了不同线虫密度接种后及标准线虫负荷感染后多个时间点WT和转基因植株的黄酮类和脯氨酸水平。结果表明，WT和转基因植株的黄酮类和脯氨酸含量均随接种密度增加而升高，但LKF3H2过表达株系含量始终显著高于WT（p < 0.05）。接种60、80、100和200条线虫时，转基因植株黄酮类含量分别为1.18、1.46、1.63和1.79 mg/g，均显著高于WT（1.03、1.24、1.42和1.57 mg/g）；脯氨酸呈平行趋势，转基因植株分别为22.21、29.34、28.76和34.35 mg/g，显著高于WT（11.62、14.89、16.62和19.9 mg/g）。接种200条线虫后的时间进程分析进一步显示两种代谢物在10 d内持续积累，转基因植株各时间点均显著高于WT：接种后1、4、7和10 d转基因黄酮类含量分别为1.26、1.58、2.43和3.12 mg/g，显著超过WT（1.12、1.37、1.94和2.97 mg/g）；转基因脯氨酸水平分别为26.26、31.46、28.19和34.35 mg/g，均显著高于WT（17.98、22.02、24.33和26.25 mg/g）。这些结果表明LKF3H2过表达增强拟南芥黄酮类和脯氨酸生物合成，尤其在高线虫压力和海侵染后期，支持LKF3H2通过上调关键防御相关代谢物参与线虫抗性的模型。

讨论部分，4.1 LKF3H2赋予拟南芥增强的松材线虫抗性：本研究从前期转录组数据集中鉴定LKF3H2并在拟南芥中进行功能表征，异源表达显著增强其对PWN的抗性；WT植株接种后表现典型萎蔫脱水症状，而LKF3H2-OE转基因株系症状明显较轻且发病率显著降低（40% vs. WT 76%），证明该落叶松基因在异源系统中赋予线虫抗性的功能保守性。增强的抗性可能由PWN挑战后LKF3H2表达的显著上调介导，结果揭示接种后LKF3H2明确的剂量和时间依赖性诱导，表明其为病原响应基因，是植物防御信号级联的组成部分，这种诱导表达模式与许多防御相关基因的作用一致，其转录激活幅度与病原攻击强度相关。异源表达在拟南芥中为树木基因功能验证提供了便利平台，但其局限性已有文献记载：同一针叶树基因可能因异源遗传背景不同而产生显著不同的功能输出，如Douglas-fir的PmLEC1在拟南芥lec1-1突变体中诱导胚胎程序，而在野生型中过表达则导致顶端优势丧失和灌木表型且未能形成类胚结构，表明拟南芥内源调控网络可实质性重塑外源基因的表型效应；此外异源过表达可能遭受转基因沉默和表达丰度失真，如Pinus pinaster的PpWOX2在拟南芥中过表达后T2代表型正常植株频率显著高于T1代，推测由35S启动子介导的转基因沉默所致，转录水平可能不反映实际蛋白丰度，且PpWOX2未显著上调AtWUS或AtWOX2，表明针叶树转录因子可能因序列分化而无法与拟南芥下游靶标重建有效调控互作。因此，拟南芥中观察到的增强抗病性需通过日本落叶松本身的遗传转化或瞬时表达试验进一步确认。4.2 LKF3H2通过黄酮类和脯氨酸积累调控防御响应：为阐明LKF3H2介导抗性的潜在机制，分析了关键防御相关代谢物的积累，发现LKF3H2过表达在不同接种密度和时间进程中均显著促进PWN感染后拟南芥黄酮类和脯氨酸的生物合成，表明LKF3H2有助于强化生化防御屏障；升高的黄酮类可能直接阻碍线虫发育或减轻氧化损伤，同时脯氨酸作为已知的渗透保护剂和活性氧（ROS）清除剂，其积累可能有助于生物胁迫下维持细胞稳态；这种不同防御代谢物的协同上调凸显了LKF3H2协调多方面防御响应的潜在机制。4.3 LKF3H2在平衡生长与防御中的双重功能：除赋予抗性外，LKF3H2过表达还促进拟南芥一系列有利发育表型，包括株高增加、抽薹和开花提前及单株角果数增多，呈现单基因正向调控生长和防御这两个常因资源分配权衡而被认为拮抗的过程的有趣案例；结果与某些基因可作为协调生长与胁迫响应平衡的中心节点的新兴证据相呼应，如苹果MdFRK2和拟南芥RPW8.1等基因的类似双重功能已被报道，可在不损害甚至促进生长的同时增强胁迫耐受性；LKF3H2同时增强生长和抗性表明其可能作用于优化植物适合度的基础调控途径，可能通过调节初级碳代谢或激素信号实现，值得进一步研究。

结论部分翻译：本研究证明日本落叶松LKF3H2基因是一个主效调控因子，能够同时增强拟南芥的生长和线虫抗性。这种双重功能由线虫感染时LKF3H2的转录激活及随后黄酮类和脯氨酸的协同积累所介导。这些发现确立LKF3H2作为旨在打破生长-防御权衡的基因工程策略的首选候选基因，为作物和森林树木改良提供重要潜力。