整合细胞培养-纳米孔测序技术用于肠道病毒B型多种型别同步检测与感染性定量

《Applied and Environmental Microbiology》：An integrated cell culture–nanopore sequencing (ICC-NanoporeSeq) method for the simultaneous detection of multiple enterovirus types and quantification of infectious Enterovirus B

肠道病毒（Enteroviruses, EVs）是地表水中普遍存在的污染物，可在水体中长期保持感染性。目前大多数EV监测方法无法区分感染性与非感染性颗粒，也无法区分不同EV型别。由于不同型别在环境持久性和健康影响方面存在显著差异，因此有必要开展型别分辨的感染性测量。本研究开发了整合细胞培养-纳米孔测序（ICC-NanoporeSeq）方法，该方法将短期细胞培养扩增与VP1基因纳米孔测序相结合。ICC方案改编自先前描述的整合细胞培养-逆转录定量聚合酶链反应（ICC-RTqPCR）方案，而NanoporeSeq工作流程源自临床EV分型方案，并针对环境中循环的EV型别进行了优化。在含有已知浓度10种EV型别的样本中，NanoporeSeq方法在校正偏差后能够准确且可重复地恢复所有EV型别的原始比例。将该方法应用于废水提取物时，检测到来自五个物种的45种EV型别。此外，利用ICC-NanoporeSeq生成的型别特异性校准曲线，实现了对肠道病毒B属（Enterovirus B）六种EV型别感染性浓度的定量，从而能够在混合样本中同时进行型别分辨的感染性评估。总体而言，ICC-NanoporeSeq为多种EV型别的平行分析提供了一种可扩展的方法。相较于前身ICC-RTqPCR方法，它无需设计多种型特异性PCR引物，因此可以便捷地扩展至更多EV型别。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

肠道病毒（Enteroviruses, EVs）是一类无包膜的单链RNA病毒，感染者粪便中排出大量病毒颗粒，导致其通过污水排放进入水环境。由于EVs在水体中具有高度环境稳定性，可长期保持感染性，因此成为重要的水环境污染物。然而，现有水质监测手段存在两大瓶颈：其一，常规分子检测方法如定量聚合酶链反应（qPCR）仅能测定病毒基因组拷贝数，无法区分感染性与失活病毒颗粒；其二，传统基于细胞培养的感染性检测虽能识别活病毒，但耗时长（数天至数周），且无法区分共循环的不同EV型别。鉴于不同EV型别对环境胁迫的耐受性和公共卫生意义迥异，亟需一种能够实现型别分辨的感染性定量方法。

此前发展的整合细胞培养-逆转录定量聚合酶链反应（ICC-RTqPCR）虽能定量特定型别的感染性浓度，但其依赖预先设计的型特异性引物，难以适应环境样本中复杂多变的EV种群结构，可扩展性受限。

二、研究目标与核心发现

为解决上述问题，研究人员开发了整合细胞培养-纳米孔测序（ICC-NanoporeSeq）方法。该方法的核心创新在于：用高通量纳米孔测序替代传统的型特异性RT-qPCR，通过一次性测序即可实现多种EV型别的同步鉴定与定量。研究选取欧洲污水中最常见的10种肠道病毒B属（EV-B）型别（柯萨奇病毒B1-B5、A9及埃可病毒6、11、25、30型）作为模型体系，系统验证了方法的准确性、可重复性、灵敏度及环境适用性。关键结论包括：经偏差校正后，NanoporeSeq可精确恢复混合样本中各型别的原始比例；结合细胞培养步骤建立的型特异性校准曲线，可实现对6种EV-B型别感染性浓度的并行定量；在瑞士四个城市废水中成功检测到横跨EV-A、EV-B、EV-C及鼻病毒A/B的45种EV型别，证实了该方法的环境应用潜力。

三、关键技术方法

研究采用的主要技术方法包括：（1）整合细胞培养（ICC）：将含混合EV种群的样本接种于人横纹肌肉瘤（RD）细胞，于感染后20小时刮取细胞并进行冻融裂解，使仅有感染性的病毒得以复制扩增；（2）VP1基因扩增与纳米孔测序（NanoporeSeq）：基于半巢式逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增VP1基因约400bp片段，采用牛津纳米孔技术公司（ONT）的Native Barcoding Kit V14构建文库，在MinION Mk1C设备上进行24小时测序；（3）生物信息学分析：使用改良的Snakemake流程（基于van Ackeren等公开脚本），将序列比对至包含751条EV序列的自建数据库（含538条临床序列及213条环境分离株序列），通过读长计数实现型别鉴定与相对丰度计算；（4）偏差校正策略：分别量化测序偏差、提取/扩增偏差及感染性偏差（基因组拷贝数与感染性滴度比值），通过顺序校正使各实验条件下的丰度分布趋于一致；（5）型特异性校准曲线建立：向样本中加入恒定量的埃可病毒3型（E3）VP1扩增子作为内参归一化子，建立E3归一化读长与输入感染性浓度（最可能数MPN/mL）之间的线性回归关系。样本来源包括芬兰国家卫生与福利研究所提供的环境分离株、美国模式培养物保藏中心（ATCC）实验室株以及瑞士洛桑、明尼阿波利斯等地污水分离株；环境验证样本来自瑞士巴塞尔、日内瓦、卢塞恩和纳沙泰尔四座城市的污水处理厂进水。

四、研究结果

1. NanoporeSeq性能评估

相对丰度分析：在扩增子实验中，将10种EV型别的VP1扩增子等量混合后测序，所有型别均被检出，相对丰度介于4.3%-22.5%（理论值10%），五次重复间平均变异系数（CV）仅3.2%，表明测序偏差可忽略。在病毒悬液实验中（等基因组拷贝数混合），各型别相对丰度差异悬殊（0.1%-40.5%），柯萨奇病毒B4（CVB4）和B5（CVB5）显著高估，而埃可病毒6型（E6）和11型（E11）严重低估，揭示出明显的提取/扩增偏差（读长比值从E6的0.01到CVB4的17.97）。在细胞接种实验中（等感染性滴度混合），所有型别仍可检出，但变异性增大（平均CV=38%），反映了感染性偏差的影响——基因组拷贝数与感染性滴度的比值范围从埃可病毒25型（E25）的0.5到埃可病毒30型（E30）的3518。

偏差校正：通过顺序校正感染性偏差（除以基因组拷贝-感染性比值）和提取/扩增偏差（除以读长比值），细胞接种实验的丰度分布趋近于无偏的扩增子实验结果，证明两步校正策略可有效还原初始感染性比例。

灵敏度分析：选择最具代表性的高丰度型别CVB4和低丰度型别E6进行测试。在扩增子实验中，当目标型别占比低至0.1%时，实测丰度仍与预期值高度吻合；在病毒悬液实验中，尽管原始数据存在强烈偏差，但经提取/扩增偏差校正后，实测丰度同样接近理论值。这表明NanoporeSeq可可靠定量低至0.1%相对丰度的型别。

环境样本应用：对瑞士四城市废水RNA提取物直接进行NanoporeSeq分析，不仅检出了目标EV-B型别，还发现了EV-A、EV-C及鼻病毒A/B等多种病毒物种，共计45种型别。但由于缺乏这些额外型别的偏差校正因子，其相对丰度仅能定性比较。

2. ICC-NanoporeSeq校准曲线建立

在10种EV型别中，仅6种（CVB5、柯萨奇病毒A9即CVA9、E6、E11、E25、E30）能在RD细胞中于20小时内有效复制。针对这6种型别，以4个相邻浓度的感染性滴度（10¹-10⁴ MPN/mL）构建校准曲线。所有曲线的回归斜率均具统计学显著性（P<0.05），决定系数R²范围为0.68-0.95（E30较低为0.37）。这些曲线可将测序获得的E3归一化读长转换为初始感染性浓度估计值。其余4种型别（CVB1、CVB2、CVB3、CVB4）未显示复制迹象，提示需改用其他细胞系（如非洲绿猴肾BGMK细胞）。

3. ICC-NanoporeSeq与最可能数法（MPN）的比较

在日内瓦湖水基质中，将6种可复制型别以10⁵ MPN/mL混合后，通过ICC-NanoporeSeq估计的感染性浓度与单独以10⁶ MPN/mL进行MPN定量的结果总体可比。两种方法对CVB5、CVA9和E11的估计值较为接近，而对E6、E25和E30的差异均在1个数量级以内。这表明ICC-NanoporeSeq能提供与经典MPN法一致的感染性定量结果，且具备同时分析多种型别的优势。

五、讨论与结论

讨论要点：研究指出，NanoporeSeq在适当偏差校正下可作为稳健的定量工具解析混合EV种群组成。提取/扩增偏差校正可实现总病毒（感染性+灭活）的型别分布定量；若进一步获知基因组拷贝-感染性比值，还可解析感染性组分。在环境样本中，即使缺乏完整偏差校正因子，NanoporeSeq仍可用于型别鉴定和多样性表征。细胞培养步骤的整合使感染性评估成为可能——病毒在细胞内的复制增量与初始感染性浓度成正比，从而可通过校准曲线建立定量关联。然而，并非所有EV型别均能在RD细胞中有效复制（本研究中4种未复制），这凸显了宿主细胞选择的重要性，未来可引入BGMK或HeLa等多细胞系以扩大覆盖范围。此外，方法仍需依赖纳米孔测序设备和生物信息学能力，标准化湿实验和干实验流程是提升其稳健性和普适性的关键。

研究结论：ICC-NanoporeSeq为EV研究和监测提供了一个多功能框架。在不含细胞培养步骤时，该方法可直接用于环境样本的EV型别组成表征，支持废水流行病学和环境监测应用；当与感染性检测结合时，可同时对6种EV型别进行感染性评估，特别适用于消毒灭活研究和病毒环境持久性研究。与传统单型别MPN法相比，并行分析多种型别的能力大幅节省了时间和实验资源。总之，ICC-NanoporeSeq提供了一种可扩展的方法，用于混合样本中多种EV型别的平行分析，消除了对多种型特异性PCR引物的需求，因此可便捷地扩展至更多EV型别。