《Journal of Bacteriology》：msDNA: the story of a unique satellite DNA molecule in bacteria
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msDNA（多拷贝单链DNA，multi-copy single-stranded DNA）是一种在细菌细胞DNA提取物中观察到的小型卫星DNA。一种通常位于染色体上的遗传元件——retron，负责产生msDNA。这种小型单链DNA具有独特结构，是通过以RNA
msDNA（多拷贝单链DNA，multi-copy single-stranded DNA）是一种在细菌细胞DNA提取物中观察到的小型卫星DNA。一种通常位于染色体上的遗传元件——retron，负责产生msDNA。这种小型单链DNA具有独特结构，是通过以RNA为模板的逆转录（reverse transcription）合成的。Retron和msDNA广泛存在于多种不同的细菌物种中。msDNA分子也已被开发为基因工程和基因组编辑的重要工具。但数十年来，这种独特DNA分子的生物学功能一直是个谜。近期研究发现表明，retron元件可通过流产感染（abortive infection）策略保护细菌免受病毒（噬菌体）感染，而msDNA分子是这一抗噬菌体特性所必需的。本文对该异常DNA分子的历史视角、其功能的最新突破以及当前和未来可能的研究方向进行了讨论。
引言部分回顾了msDNA的发现历程：研究人员Thomas Yee在Inouye教授实验室开发了二维凝胶电泳系统，用于检测黄色黏球菌（Myxococcus xanthus）染色体中的序列重复和不匹配。在5%聚丙烯酰胺凝胶上电泳未酶切的染色体DNA后，观察到一条突出的卫星DNA条带，大小仅约160个核苷酸，可被S1核酸酶消化，表明其为单链DNA。由于M. xanthus每个细胞可产生多达700个拷贝，故命名为多拷贝单链DNA（msDNA）。这一发现同时揭示了细菌中首个逆转录酶（reverse transcriptase, RT）型DNA聚合酶的存在。
msDNA的结构特征部分指出：对M. xanthus msDNA直接测序时发现，5′端放射性P32标记在哌啶化学裂解中大部分被去除，表明至少有一个核糖核苷酸连接在5′端。进一步实验显示，msDNA实际上与一条77个核糖核苷酸的RNA链相连。最不寻常的是连接方式：msDNA的5′端通过内部鸟苷核糖核苷酸的2′羟基（2′-OH）与RNA形成独特的2′–5′键。Mx162 msDNA的基本结构特征在大多数后续发现的其他细菌msDNA中保守存在，包括：（a）通常折叠成长茎环结构的单链DNA聚合链（msdDNA或RT-DNA）；（b）通过内部鸟苷核糖核苷酸（常前置核糖-A和核糖-T）的2′-OH与DNA 5′端相连的单链RNA链（msrRNA），可形成一个或两个茎环折叠结构；（c）msrRNA 3′端约5–8个核糖核苷酸与RT-DNA 3′端互补碱基配对，形成短的DNA-RNA异源双链。变形菌门retron中还观察到非保守结构变异，包括Ec86 msrRNA 5′端短的RNA-RNA碱基配对双链，以及Ec78、Ec83和St85等“去分支”（debranched）msDNA分子——其RT-DNA 5′端不再与msrRNA相连。
细菌逆转录酶的发现部分描述了：在M. xanthus染色体中发现了与msDNA（RT-DNA）序列相同的序列码，命名为msd基因；msrRNA的互补序列命名为msr。这两个序列方向相反，并重叠8个碱基——恰好对应Mx162 msDNA DNA-RNA异源双链中的8个碱基。早期实验表明，M. xanthus细胞产生一条长初级mRNA转录本，同时拷贝msr和msd基因以及两个侧翼反向重复序列a1和a2。基于这些线索，Inouye研究组提出该卫星单链DNA分子是通过mRNA模板逆转录合成的。随后快速完成了Mx162（Mxa1）、Ec67（Eco2）和Ec86（Eco1）retron msd基因上游区域的DNA测序，均发现与msd相邻的开放阅读框编码RT型聚合酶。尽管三者氨基酸序列互不相同，但均含有逆转录病毒RT和真核RT中保守的氨基酸区域，明确将其归入同一聚合酶家族。
msDNA的合成机制部分阐明：从染色体retron转录产生非编码RNA（ncRNA），该ncRNA拷贝msr和msd基因及上下游区域。侧翼区域编码一对保守反向重复序列：a1紧邻msd起始端，a2位于msr起始端上游并轻微重叠。这些反向重复序列可碱基配对，使ncRNA折叠成一系列茎环结构。最重要的是，a1与a2的碱基配对将ncRNA中特定鸟苷核糖核苷酸（“分支G”）置于折叠ncRNA中的正确位置，使其作为retron RT起始DNA合成的引物。Retron RT的独特之处在于能够利用该内部鸟苷核糖核苷酸的2′-OH基团作为引物启动DNA合成。RT的thumb结构域识别该“分支G”核苷酸及ncRNA中的茎环结构，以部分ncRNA（msd）为模板开始聚合DNA（RT-DNA）。合成过程中，细菌核糖核酸酶H（RNase H）切除部分模板RNA。DNA聚合和模板去除过程持续进行，直至在到达ncRNA模板末端前意外终止，因此部分ncRNA模板保留在成熟msDNA分子中与RT-DNA 5′端相连。RT-DNA合成的终止主要受RT-DNA和msrRNA三级结构影响。
msDNA的分布部分指出：msDNA最初在两个黏球菌——M. xanthus和Stigmatella aurantiaca的DNA提取物中观察到。使用放射性P32核苷酸特异性标记msDNA的高灵敏方法，在多种革兰氏阴性菌（包括许多根瘤菌成员）的RNA提取物中检测到msDNA。Retron型RT是细菌RT中第二常见的类别（12%–14%），仅次于更丰富的II类内含子编码RT（57%–75%）。约22%的变形菌门基因组似乎至少含有一个retron型RT基因，而108个螺旋体基因组中仅5个含有。Mestre等基于ncRNA共识结构和retron RT蛋白系统发育，将所有retron分为13种不同类型，并提出每种retron类别可能相关的“效应”蛋白。Khan等合成并表达了100多个生物信息学预测的ncRNA及其RT基因，发现98个新测试的retron中62个可产生卫星msDNA。
msDNA功能的揭示部分阐述：早期研究将msDNA与可观察表型联系起来——Ec86（Eco1）过表达导致msDNA过量产生并具有致突变性，因RT-DNA长茎环中存在错配碱基对，过量产生结合MutS蛋白导致回复突变增加；鼠伤寒沙门菌不能产生msDNA严重影响肠道持续定植所需的中枢厌氧代谢。细菌基因组广泛测序和基因组织比较带来关键突破：许多防御簇中含有靠近已知噬菌体防御基因（如限制性内切酶）的RT基因，表明retron元件存在于噬菌体防御岛中。实验证明大肠杆菌、沙门菌和弧菌中约十余种不同retron元件确实通过显著降低噬菌斑实验中的接种效率保护细菌免受噬菌体感染。Retron元件由三个功能部分组成：（i）RT基因；（ii）含msr和msd基因的ncRNA，其中msd被逆转录为msDNA（RT-DNA）；（iii）效应基因，常编码对细菌细胞有毒的蛋白质。 exhaustive突变构建表明每个功能部分（包括RT-DNA）均为retron元件抗噬菌体活性所必需。
msDNA作为更大的多分子“Retron复合体”的关键结构组分部分指出：Ec67 retron RT与msDNA共纯化，以包含RT蛋白、msDNA和部分RNA模板（msrRNA）的极大分子量复合体形式从色谱柱洗脱。基于纯化RT复合体的冷冻电镜结构，研究者提出了Ec67 retron防御复合体的高分辨率结构。Ec67 RT较长（586个氨基酸），因RT结构域与retron效应子融合为C端RNase H样“TOPRIM”（拓扑异构酶-引物酶）结构域。纯化的“静息复合体”形成紧密三聚体结构，含三个RT-Toprim蛋白拷贝和三个msDNA分子拷贝及其剩余RNA模板。高分辨率结构还提出三个RT-DNA的部分区域彼此碱基配对，在retron复合体中心形成三角形三向连接。其他retron防御系统的高阶结构（如Eco8的4:4:4结构，含四个RT、四个msDNA和四个效应蛋白拷贝）通常比Ec67更大更复杂。msDNA是这些多分子组装体的关键组分——RT-DNA中与RT和效应蛋白强相互作用的特定核苷酸位点突变会损害Eco8复合体的抗噬菌体活性。
msDNA作为检测噬菌体感染的传感器部分详细列表说明：不同retron类型利用msDNA感知不同噬菌体触发因子。例如，Ec86（Eco1）中噬菌体DNA胞嘧啶甲基转移酶（DCM）甲基化msDNA中的CCTGG识别位点，引起retron复合体构象变化并激活防御系统；Ec67（Eco2）中噬菌体蛋白DenB（T2）或A1（T5）切割msDNA，将msDNA从三聚体复合体中移除，激活毒性效应子；Ec83（Eco4）和Ec78（Eco7）中噬菌体编码的瓣状内切核酸酶切割msDNA，导致复合体解体和毒性Septu效应子（PtuAB）释放；Ec48（Eco6）中噬菌体Gam蛋白可能将msDNA从宿主RecBCD上置换，激活RecBCD抗噬菌体特性；Eco8中噬菌体单链结合蛋白（SSB）与msDNA茎环双链结合并解旋，破坏msDNA将效应蛋白（OLD核酸酶）捕获在失活状态的能力；Eco11中噬菌体解旋酶UvsW（T4）和D10（T5）与msDNA相互作用引起复合体重排；St85（Sen2）中噬菌体RecE蛋白降解msDNA，破坏毒素-抗毒素复合体；Vpa2中无噬菌体感染时msDNA不产生，λ感染后retron RT被“解锁”产生msDNA，进而去阻遏毒性效应子的翻译；Kva2中噬菌体DNA结合蛋白D5（T5）结合msDNA茎环，引起构象变化并释放催化活性HEPN RNase；Sen3/Yin1中噬菌体核酸酶（如B14）切割msDNA茎环，释放催化活性HEPN核糖核酸酶。
msDNA作为抗毒素部分阐明：大多数显示抗噬菌体活性的retron中，编码效应蛋白的基因位于RT和ncRNA基因（msr-msd）邻近。效应蛋白激活时对细菌细胞具有不同程度毒性，通常为核酸酶，引起某种形式的细胞损伤触发流产感染——通常导致细胞死亡或生长停滞，从而阻断噬菌体完成复制和产生子代病毒颗粒。RT-DNA的茎环折叠似乎是这些多蛋白retron复合体组装和稳定的支架。此外，msDNA的RT-DNA还作为抗毒素，通过抑制或将效应蛋白捕获在失活（无毒）状态发挥作用。例如，Ec86（Eco1）中RT-DNA长茎环直接接触效应二聚体，形成围绕二聚体蛋白的“笼”结构，抑制其毒性（NAD+水解）活性；缩短茎环结构的RT-DNA突变导致细菌基本停止生长，表明截短的RT-DNA不再发挥抗毒素功能。Retron似乎是一种新型毒素-抗毒素元件，利用msDNA作为抗毒素。
黏球菌（XIII型）retron部分指出：尽管首个msDNA和retron在黏球菌中发现，当前研究主要集中于大肠杆菌及其近缘种中的retron。但黏球菌的XIII型retron与大肠杆菌中的retron差异显著。大肠杆菌基因组中存在多种类型和亚型的retron元件，但在自然群体中零星分布；而黏球菌则不同——对20株不同M. xanthus的早期调查表明所有菌株均产生与Mx162（Mxa1）不可区分的msDNA；来自7个不同属的28株黏球菌均含有类似的Mx162样（Mxa1）retron和msDNA，表明XIII型retron自这些物种约1.5亿年前共享共同祖先以来一直存在于其基因组中。此外，XIII型retron（尤其是Mx162/Mxa1）似乎产生大量卫星msDNA分子，而大肠杆菌retron产生的量较少且难以检测。
讨论部分总结：自40多年前发现以来，msDNA以其奇特结构、逆转录合成机制以及作为许多细菌物种新型抗噬菌体防御系统等方面不断带来惊喜。Retron可在活细胞内合成许多拷贝的序列特异性单链DNA（msDNA），这成为基因工程中高度理想和可利用的工具，持续被开发用于各种生物技术应用，特别是作为在真核细胞（包括人类细胞）基因组中引入精确编辑的模板。细菌细胞似乎也将msDNA用作遗传工具——对于目前深入研究的许多大肠杆菌retron，细菌利用msDNA作为噬菌体检测器，msDNA分子在其首个被定义的生物学功能中充当通常结合DNA的噬菌体编码蛋白的辅助靶标，触发retron的抗噬菌体功能。最新研究提示msDNA可能以截然不同的方式发挥作用，作为VI型retron抗噬菌体活性的反义调节因子。msDNA是否还有其他生物学功能？细菌可能将msDNA分子用于其他目的。存在不符合当前标准三功能模块模型的retron操纵子——例如Ec107（Eco5）似乎不与任何效应基因相关，位于pyrE和slmA之间的基因间区，其RT未与效应结构域融合但 clearly 产生msDNA，可能与未知效应蛋白反式作用。在细菌基因组中9000多个潜在retron的广泛调查中还注意到许多其他缺乏可识别效应模块的“孤儿”retron。Ec107位于slmA基因附近值得关注——SlmA蛋白通过阻断FtsZ聚合和Z环复合体形成在细胞分裂时染色体分离中发挥作用，且SlmA是结合DNA的TetR样蛋白，Ec107 msDNA分子是否在SlmA蛋白的激活或功能中发挥作用值得探究。大肠杆菌retron似乎是近期获得的选择——众多可能噬菌体防御系统之一；但黏球菌中XIII型retron的垂直遗传及其独特的RT和ncRNA结构提示长期进化的功能，可能不同于抗噬菌体防御。最后，在黏球菌Nannocystis exedens中观察到一种不寻常的retron Ne160（Nex1），产生典型msDNA分子和retron型RT，但除retron拷贝外，该菌基因组中还有众多RT-DNA（msd）序列的部分拷贝，来源和功能未知——或许msDNA在此作为单链DNA底物供参与修复细菌细胞受损DNA的修复蛋白使用。Retron是高度多样且广泛分布的遗传元件群体，随着对这一独特DNA分子研究的继续，无疑将有更多有趣的惊喜和可能的新功能被发现。
