基于两栖动物认知视角的活体两栖动物圈养繁育与野外研究标准指南及方法修订建议

《Methods and Protocols》：Perspectives on Standard Guidelines and Methods for the Use of Live Amphibians in Captive Rearing Programs and Field Research

　　

美国鱼类学家与爬行动物学家学会《野外与实验室研究中活体两栖动物与爬行动物使用指南》（Guidelines for Use of Live Amphibians and Reptiles in Field and Laboratory Research，以下简称Guidelines）普遍倡导在野外和圈养条件下人道对待并保护这些动物。为使该倡导保持相关性，Guidelines必须定期更新，原因在于：（1）通过对代表形态、生态和行为多样性的多种物种进行研究所得发现，以及（2）对这类脊椎动物认知能力（包括记忆获取、环境感知和自我感知）认识的进步，使研究人员对两栖动物的集体知识不断增加。同样，野外技术的标准方法（Standard Methods）建议以操作指南方式可提供极大帮助。然而，标准方法建议往往预设一种"一刀切"哲学，这可能与其力图确保的数据质量相悖，并在某些情况下可能违反Guidelines的原则。在此，研究人员以对穴居蛙（Crawfish Frogs，Rana areolata）的研究及对两栖动物认知的观点为例，旨在：（1）建议放宽Guidelines对个体福利的普遍强调，纳入为群体健康而可能牺牲个体健康的情形（即修改现行"不伤害"政策，转而采用"长远而言为最大多数谋最大利益"的政策，尤其是在圈养繁育与野放项目中）；（2）建议扩展Guidelines，不仅强调动物在圈养期间的考量，也强调其野放后的福利；（3）建议更新标准方法以符合Guidelines建议。研究人员的最终目标是：首先通过拓宽Guidelines所采取的方法改善两栖动物状况；其次使标准方法与Guidelines建议相一致，使两者均与当前关于两栖动物饲养和野外技术的知识与实践保持同步。

研究背景方面，美国鱼类学家与爬行动物学家学会发布的《野外与实验室研究中活体两栖动物与爬行动物使用指南》（Guidelines）普遍倡导在野外与圈养条件下人道对待并保护两栖动物，其核心原则为"不伤害"（do no harm），聚焦于人类照管下个体动物的福利。与此同时，标准方法（Standard Methods）建议为野外技术提供操作指南，但往往预设"一刀切"哲学。随着对两栖动物形态、生态和行为多样性认识的增加，以及对这类脊椎动物认知能力（包括记忆获取、环境感知和自我感知）理解的进步，Guidelines需要定期更新以保持相关性。现有问题在于：Guidelines的"不伤害"原则在圈养繁育与野放项目中可能适得其反，因为在圈养中满足发育中脊椎动物的全部需求可能对其野放后不利——发育中的大脑必须接受挑战才能形成适应野外生存所需的神经连接；从未在圈养中搜寻食物的动物可能无法在野外觅食；从未体验恐惧或已习得大型逼近物体（即接近的人类）意味着食物的动物，可能无法识别自然界中大型逼近物体很可能是捕食者。此外，许多圈养繁育项目的成功仅以饲养和释放的动物数量衡量，而未考虑野放后能否存活至繁殖并重建种群这一终极目标。同时，标准方法建议可能与Guidelines原则相冲突，例如陷阱检查频率、无线电发射器附着方式以及PIT标签植入方法等，可能对动物造成伤害或认知应激。因此，研究人员开展此项研究，旨在通过实例提出对Guidelines和标准方法的修订建议，以改善两栖动物福利并使两者与当前知识同步。

研究人员基于2009至2016年以及2019至2023年 follow-up 研究期间，对穴居蛙（Crawfish Frogs，Rana areolata）种群的研究（采集了超过1100个个体的数据，使其成为已知研究最密集、最广泛的两栖动物种群之一），结合对两栖动物认知的观点，提出三项建议：（1）放宽Guidelines对个体福利的普遍强调，纳入为群体健康而可能牺牲个体健康的情形，即修改现行"不伤害"政策，转而采用"长远而言为最大多数谋最大利益"（the greatest good for the greatest number in the long run）的政策，尤其是在圈养繁育与野放项目中；（2）扩展Guidelines，不仅强调动物在圈养期间的考量，也强调其野放后的福利；（3）建议更新标准方法以符合Guidelines建议。研究结论指出，当前伦理往往始于并终于研究人员照管下的动物，这并不总是有利于 destined to be released into the wild 的动物，建议将伦理时间框架扩展至涵盖动物整个生命周期。其重要意义在于：首先通过拓宽Guidelines所采取的方法改善两栖动物状况；其次使标准方法与Guidelines建议相一致，使两者均与当前关于两栖动物饲养和野外技术的知识与实践保持同步。

在技术方法方面，研究主要采用以下关键技术：漂篱—漏斗陷阱阵列（drift fence-pitfall trap arrays）用于采样进入和离开繁殖湿地的成年繁殖两栖动物及变态后幼体；无线电遥测（radiotelemetry）用于追踪个体运动，包括手术植入发射器（implanted transmitters）和外部附着发射器（externally attached transmitters，如金属珠链腰带）；被动集成应答器（PIT，passive integrated transponder）标签植入用于个体识别；以及捕获—标记—重捕（CMR，capture–mark–recapture）野外研究。样本队列来源为印第安纳州（Indiana）的穴居蛙种群，研究经印第安纳州自然资源部科学用途许可证及印第安纳州立大学机构动物护理与使用委员会协议批准。

研究结果部分：（1）关于野放后的动物福利（Animal Welfare Following Release）：研究人员指出，Guidelines当前聚焦于人类照管下个体动物的福利，采用"不伤害"哲学，这对展示、圈养繁育亲本、救助种群或观察实验研究中的两栖动物效果良好，但对于 destined to be released into the wild 的圈养繁育动物，在"不伤害"哲学下饲养可能如同死刑判决，圈养繁育动物重建两栖动物种群失败的记录充分证明了这一点；研究人员建议对 destined to be released into the wild 的发育中两栖动物进行现实挑战，如使其搜寻食物以体验努力后的奖赏感，并牺牲少数动物以向其余多数暴露警示信息素（kairomones）和惊吓物质（schreckstoff），使其了解与恐惧相关的感受；在此类情形下，适当哲学应为Jeremy Bentham借用Gifford Pinchot作为美国林务局座右铭的"长远而言为最大多数谋最大利益"；研究人员还建议扩展Guidelines覆盖范围，强调动物圈养期结束后野放后的健康与福祉，指出许多圈养繁育项目以饲养和释放数量衡量成功，却忽视无一动物存活至繁殖并重建种群这一终极目标，当野生饲养动物能建立新种群而圈养饲养的健康动物不能时，必存在独立于可观察健康之外的至少一个缺失因素。（2）关于标准方法中若考虑Guidelines协议将得到改进的技术（Standard Methods Techniques That Would Be Improved if Guidelines Protocols Were Considered）：在漂篱—漏斗陷阱采样程序（Drift Fence-Pitfall Trap Sampling Procedures）方面，研究人员发现，在繁殖季早期仅雄性进入湿地时，每日清晨检查陷阱并释放动物至湿地即可；但在动物繁殖后离开湿地时，Corn、Dodd和Scott及Guidelines的检查频率方法对每种物种均不令人满意，假设每日清晨检查和清空陷阱，离开繁殖湿地的两栖动物最多在桶中受约束一整夜，但许多上午释放的两栖动物因白天而无法继续迁移或扩散，且可能在距湿地仅数米处暴露于捕食者；研究人员在开始使用无线电遥测追踪穴居蛙后意识到，通过滞留夜间雨中离开湿地的繁殖后动物而使其面临危险，且导致蛙在试图返回高地洞穴时撞向围栏而受伤（吻部擦伤、薄皮裂开），鉴于该州濒危物种个体可能受到致命伤害，研究人员开始在有利迁移的雨夜进行整夜监测，持续检查方法很少将动物滞留超过一至两小时，确保动物始终在黑暗中、通常仍在降雨时释放至围栏另一侧；研究人员还指出，让动物在漏斗陷阱中停留长达三天会周期性暴露于午后高温和干燥条件，挑战其稳态能力，且鉴于对两栖动物学习、记忆和感知能力的认识，两栖动物在18 L桶中受困三天可能经历难以辩护的认知应激。在发射器附着观点（A Perspective on Transmitter Attachments）方面，研究人员指出，在短期圈养中创造的人道条件可能掩盖野放后长期经历的不人道条件，最佳例子是无线电遥测研究中附着还是植入发射器的问题；将发射器通过珠链腰带系于蛙腰部比手术植入更人道，但在发射器电池约6个月寿命期间，哪种技术对动物应激最小值得探究；研究人员对穴居蛙（大型、穴居物种）的经验表明植入发射器是更好选择，蛙从手术麻醉（tricaine methane sulfonate: MS 222）恢复后行为正常，不受拖拽外部发射器和天线穿过茂密草原植被的负担，在繁殖前后迁移期间每晚可移动400至500米；外部附着发射器不仅会减慢动物运动，发射器—腰带阵列还可能缠结于植被并使其易被捕食者捕获；为比较植入与附着发射器对穴居蛙的影响，研究人员使用金属珠链标准技术外部附着了一部分发射器，结果灾难性：链条磨损敏感的腹部皮肤，切穿表皮和真皮直至浅层肌肉（腹直肌和腹外斜肌），研究人员发现这些动物后立即带入实验室麻醉并缝合伤口；一例中固定发射器于腰带的胶水失效导致一只雄性失联，两年后其再次出现在繁殖湿地，腰部有水平疤痕，表明珠链在锈蚀脱落前必定持续磨损皮肤；研究人员还引用文献指出，缎带腰带在哥伦比亚斑点蛙（Rana luteiventris）腰部和臂部造成皮下擦伤和更深的外部肌肉损伤，聚乙烯管腰带在西蟾（Anaxyrus boreas）中造成轻度皮肤擦伤和更显著的开放性伤口；研究人员指出，若追踪水生蛙科动物（如美洲牛蛙R. catesbeiana、绿蛙R. clamitans或山地黄腿蛙R. sierrae、R. muscosa），会考虑使用腰带外部附着发射器，因为外部附着避免手术植入后的恢复期且障碍较少，但即使在水生场景中也有发射器—腰带阵列缠结于大型水生植物、阻止动物浮出水面呼吸导致溺水的报告；追踪小型物种和幼年无尾类时同样存在该问题，研究人员对追踪幼年穴居蛙的解决方案涉及测试更轻的附着方法（同事最近用于约塞米蒂蟾Anaxyrus canorus）：用缝合线串玻璃珠而非成年常用的较重珠链腰带，意图是缝合线在发射器电池寿命期间降解，提供故障安全；该技术减少了与较重腰带相关的一些担忧，但未消除根本权衡；尽管已开发多种外部发射器附着方法，每种都在附着简便快速与蛙携带设备期间持续存在的风险之间平衡；研究人员估计在研究期间（约800公顷区域）仅丢失六个发射器（约占总使用发射器数量的8%），且发射器—电池阵列周围的聚合物是惰性的，因此抵抗环境降解。在PIT标签植入（PIT Tag Implantation）方面，研究人员指出，PIT（passive integrated transponder）标签为个体识别提供有效手段，常用于野外研究和圈养项目；该技术首先应用于蛙的腹腔内，然后用于蟾的背部淋巴囊，再用于蛙的皮下；兽医学项目和教科书常推荐使用预装大号针头注射器在不麻醉情况下穿刺皮肤并将标签滑入皮下，虽然该技术对某些两栖动物（即有尾类）有效，但研究人员对穴居蛙和其他无尾类的经验表明，这种注射器系统所宣称的简便性实际上可能笨拙且对动物有风险：大号针头在野外难以操作，造成比必要更大的切口，增加PIT标签丢失风险，更重要的是，可能显著伤害或杀死在非麻醉植入过程中抽动或跳跃的动物；研究人员认为鉴于存在一种破坏性较小的技术（包括研究人员在内的许多科学家已用于数千只蛙且负面结果很少），这种风险是不必要的：使用无菌、锋利的剪刀或指甲剪，在捏起并撑起皮肤以确保仅穿透皮肤而非深层肌肉后，在背侧或腹侧做精确切口；对较小无尾类，研究人员偏好背侧，因为可安全地一手伸直腿固定蛙，同时两指对蛙两侧施加最小压力，在肩部附近皮肤形成帐篷状，然后可将撑起的皮肤剪开略超过PIT标签宽度；对较大无尾类（包括穴居蛙），研究人员发现蛙腹面可见时手中更安全，有充足表面积撑起皮肤并将插入的标签滑离切口至皮下，降低PIT标签丢失可能性；剪刀越锋利，切口越精确；预算有限的项目可用廉价药店指甲剪；更昂贵的选择是锯齿不锈钢剪刀（如Fine Science Tools的Iris Toughcut 14058-09），可在切割时抓握滑溜的撑起皮肤；研究人员不建议在PIT标签切口上使用手术胶，因为过度应用存在风险；根据研究人员经验，这些小切口无需胶水即可快速愈合，一般在24至48小时内。研究人员总结指出，最方便或看似最不侵入的技术不一定最人道；预装注射器使PIT标签植入快速且标准化，但这些优势主要有利于研究人员而非动物，更重要的是，它们将相同技术应用于具有不同体型、皮肤特征和行为的两栖动物；因此标准方法应考虑的不仅是技术是否有效，还包括动物的解剖和行为是否允许以更人道的方式实现相同目标。

讨论部分总结：Guidelines和标准方法最初构建时占据不同领域，Guidelines历史上针对圈养动物，标准方法针对野外技术；近来圈养与野生动物之间的界线已模糊，对两栖动物种群下降的担忧已将持有动物的理由从观察或实验研究转向圈养繁育—释放项目，这些项目在动物释放后依赖标准方法追踪和监测；Guidelines在很大程度上跟上了这一变化，其当前许多建议涉及野外技术；理想情况下应对等发生，标准方法应承认Guidelines建议；部分脱节是时间性的，标准方法圣经出版于1994年，而Guidelines在线发布并偶尔更新；尽管如此，应一致同意野外动物处理必须遵守相同原则并受到与圈养动物处理相同的预防措施；更根本的是，人道对待动物应优先于研究人员的便利；野外研究人员有责任足够警觉以识别和承认技术正在损害动物健康和/或干扰其行为，任何时候动物受到损害，所采集数据的质量也受到损害，正如Guidelines强调的："受创伤的动物可能表现出异常的生理、行为和生态反应，从而挫败研究目的。"还必须承认标准方法代表的就是标准方法；鉴于目前认可9150种两栖动物（8069种无尾类），且每种物种都有定义其自身的某些形态或行为独特性，任何给定野外技术（无论是捕获方法、发射器附着方法、标签植入方法还是其他方法）必然存在种间（或许还有种内）变异性；简言之，当前伦理往往始于并终于研究人员照管下的动物，这并不总是有利于 destined to be released into the wild 的动物，建议将伦理时间框架扩展至涵盖动物整个生命周期。解决方案部分指出，解决上述动物饲养问题的方案可能来自两个来源：实践和概念；实践解决方案将来自通过定期修订（如由定期开会的学会委员会）或活文件（在新数据/观点出现后立即修改）定期更新Guidelines和标准方法的建议；概念解决方案将围绕范式转变，如果如研究人员所建议标准方法应更新以包含Guidelines建议，则Guidelines应更新至超出上述建议以考虑最近揭示的两栖动物认知能力；1970年代科学家如Niko Tinbergen和J.-P. Ewert认为两栖动物是"简单反射机器"，Ewert认为两栖动物感知的关键刺激（先天释放机制）激活固定模式的行为反应（即反射），如同钥匙配锁；一些科学家仍持此观点；但两栖动物大脑是脊椎动物大脑，与人类大脑建立在相同 Bauplan 之上，拥有前脑端脑，具有响应生态新颖性的能力，尽管以人类皮层标准衡量有限；正如Reber指出，"世界在流变，没有硬连线系统能存活其中。"两栖动物认知包括记忆，尤其是对景观特征的记忆，如（1）箭毒蛙雌性反复返回承载其蝌蚪的凤梨科植物水罐释放营养卵，以及（2）繁殖后穴居蛙返回"家"螯虾洞穴，如前所述可超过一公里远；此外，美洲牛蛙（R. catesbeiana）记住相邻雄性的广告叫声并习惯化；在其他认知能力中，穴居蛙表现出环境感知的证据，即它们知道何时暴露于捕食者并会改变行为以变得不那么显眼；穴居蛙似乎还具有自我感知，如其与束带蛇（Thamnophis sirtalis）的相对大小依赖关系所示；此外，两栖动物的认知能力因分类群而异，或许因物种而异，其方式似乎与其面临的生态挑战一致；鉴于对两栖动物认知理解的最新进展，不难想象下一代野外指南除形态、繁殖力、寿命、保护威胁等部分外，还有关于物种认知技能及其对行为影响的部分；认知无疑对这些动物的生存很重要，且该性状肯定存在种间变异；研究人员各自最初通过与所研究动物互动而产生兴趣，并通过这些互动运用专业技能更多了解它们；那么想象在正式认识到这些动物不仅仅是反射/反应机器——它们能思考——之后会产生的新认识，然后想象将这一知识纳入理解和尊重研究人员在所有各种互动中对待它们的方式；如果爬虫学领域目前正朝任何方向发展，那就是朝着正式承认两栖动物和爬行动物具有比当前物种范式所承认的更大独立行为能力的方向，正如物种描述中所阐述的；将认知能力纳入标准物种描述将使实验室和野外生物学家根植认知意识，Guidelines和标准方法建议将自然随之而来。研究结论部分翻译：Guidelines和标准方法最初构建时占据不同领域，Guidelines历史上针对圈养动物，标准方法针对野外技术；近来这一界线已模糊；理想情况下标准方法应承认Guidelines建议；野外动物处理必须遵守与圈养动物处理相同的原则和预防措施，人道对待动物应优先于研究人员的便利；鉴于目前认可9150种两栖动物（8069种无尾类），每种物种都有定义其自身的某些形态或行为独特性，任何给定野外技术必然存在种间（或许还有种内）变异性；简言之，当前伦理往往始于并终于研究人员照管下的动物，这并不总是有利于 destined to be released into the wild 的动物；研究人员建议将伦理时间框架扩展至涵盖动物整个生命周期。