加州饲料作物系统中繁缕（Stellaria media）ALS抑制类除草剂抗性种群的首次记录

《Crops》：Acetolactate Synthase Herbicide-Resistant Stellaria media (L.) Vill. Populations Documented in Forage Cropping Systems in California

　　

普通繁缕（Stellaria media (L.) Vill.）已被观察到侵入美国加利福尼亚州圣华金谷（San Joaquin Valley, SJV）南部施用乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase, ALS）抑制类除草剂的饲用小麦（Triticum aestivum L.）和黑小麦（xTriticosecale）田块。研究人员开展研究以验证这些杂草种群是否对这些除草剂具有抗性，以及抗性机制为何。研究人员从三个地点采集繁缕植株种子，代表四个种群——三个疑似抗性种群和一个疑似敏感种群。利用这些采集物培育植株，并两次开展温室剂量-反应研究，使用五种常见的ALS抑制剂：甲磺胺磺隆（mesosulfuron-methyl）、吡磺草胺（pyroxsulam）、甲氧咪草烟（imazamox）、咪唑乙烟酸（imazethapyr）和苯磺隆（tribenuron-methyl）。结果确认，其中三个种群对供试的所有五种ALS抑制类除草剂的标签剂量均具有抗性。Sanger测序鉴定出Trp574Leu置换，该突变此前与ALS抑制类除草剂的靶标位点抗性相关。这是北美落基山脉以西首次记录的繁缕种群对ALS除草剂具有交叉抗性的案例。

本研究针对美国加利福尼亚州圣华金谷（San Joaquin Valley, SJV）南部饲用小麦（Triticum aestivum）与黑小麦（xTriticosecale）田中普通繁缕（Stellaria media）对乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase, ALS）抑制类除草剂防效失败的问题展开。近年来，该地区繁缕种群对常用ALS抑制剂如吡磺草胺、苯磺隆和甲磺胺磺隆等出现耐药或抗药迹象；由于2015—2019年间加州至少39.8%小粒谷物面积依赖ALS抑制剂，且新型除草剂作用机制（mode of action, MOA）开发放缓，抗性进化成为控制失败的主要假说。此前北美尚无繁缕ALS靶标位点突变的分子证据，因此本研究旨在验证抗性存在并解析其机制。研究人员于2021年在Kings和Tulare县三个地点采集种子，获得四个种群：Organic（疑似敏感，来自未施药有机农场）、SDJ2、SDJ4和SBKF-1（疑似抗性，来自ALS抑制剂用药历史地块）。通过温室剂量-反应试验和Sanger测序，确认三个抗性种群对五种ALS抑制剂标签剂量表现交叉抗性，并鉴定出杂合的Trp574Leu靶标位点突变。这是北美落基山脉以西首次记录的繁缕ALS抑制剂交叉抗性案例，为区域抗性治理提供了关键分子证据。

关键技术方法包括：温室剂量-反应试验（dose-response bioassay）——选取五种ALS抑制剂（mesosulfuron-methyl、pyroxsulam、imazamox、imazethapyr、tribenuron-methyl），按标签剂量的0x、0.5x、1x、2x、4x和8x处理，重复两次，调查死亡率与地上部干重；采用四参数逻辑斯蒂模型（four-parameter logistic model）拟合估计半致死浓度（LC₅₀）和生长抑制中量（GR₅₀）。另对存活个体提取叶片DNA，PCR扩增ALS基因中覆盖已知突变位点的两个片段，经Sanger测序比对参考序列（GenBank HE998774.1和KF589891.1），筛查靶标位点突变。

**3.1 剂量-反应研究中的植物死亡率**
通过两个轮次的温室剂量-反应试验发现，来自有机农场的敏感种群在所有五种除草剂的各处理剂量（包括0.5x）下均被完全杀死；而三个疑似抗性种群在标签剂量下表现出高度存活，例如SBKF-1种群对mesosulfuron-methyl和pyroxsulam的存活率分别高达90%和94%，对imazamox、imazethapyr和tribenuron-methyl的存活率为91%、72%和30%。即使8倍标签剂量下，部分个体仍存活。SDJ2和SDJ4种群趋势相似。结果表明，这三个种群对五种ALS抑制剂标签剂量均具抗性，即表现为交叉抗性。

**3.2 除草剂的LC₅₀**
根据四参数逻辑斯蒂模型，敏感种群的LC₅₀因全部个体在最低剂量下死亡而无法可靠估计；mesosulfuron-methyl和pyroxsulam的抗性种群LC₅₀超出测试剂量范围亦无法计算。对于可估计的除草剂，imazamox的LC₅₀为标签剂量的2.1—3.1倍，imazethapyr约为1.1—1.5倍，tribenuron-methyl约为1.1—3.8倍，量化了不同种群间的抗性差异。

**3.3 繁缕植株的地上部干重**
与死亡率数据对应，抗性种群的地上部干重随除草剂剂量增加而下降，但存活个体仍累积生物量。在标签剂量下，mesosulfuron-methyl和pyroxsulam处理使抗性种群干重仅较对照下降10%—33%和18%—23%；imazamox的GR₅₀达到标签剂量的1.9—7.1倍，而mesosulfuron-methyl和pyroxsulam的GR₅₀因数据超出测试剂量而无法估计。可见这两种药剂难以抑制抗性种群生长。

**3.4 繁缕种群的遗传变化**
对41个存活个体进行Sanger测序，所有个体均携带ALS基因第574位密码子由色氨酸（TGG）突变为亮氨酸（TTG）的Trp574Leu置换，且均为杂合状态；敏感种群的5个个体未检测到任何已知突变。该突变是公认的靶标位点抗性（target-site resistance, TSR）突变，可导致对磺酰脲类、三唑嘧啶类和咪唑啉酮类ALS抑制剂的交叉抗性。因此，Trp574Leu突变是三种种群产生抗性的分子基础。

讨论部分指出，Trp574Leu突变此前已在英国、爱尔兰等地的繁缕种群中报道，但在美国尚属首次发现。抗性个体均为杂合型，提示抗性等位基因在圣华金谷可能近期才出现或扩散，也可能存在纯合型的适合度代价。虽然本研究确认了靶标位点抗性，但非靶标位点抗性（non-target-site resistance, NTSR）在其他繁缕种群已有报道，不应忽视。鉴于全球已出现繁缕对原卟啉原氧化酶（PPO）抑制剂、合成生长素类等产生抗性的案例，研究人员建议采用种子清洁、作物轮作、交替使用不同作用机制除草剂及机械除草等综合杂草管理措施。

结论：本研究提供了美国繁缕ALS抑制剂抗性机制的首次分子表征，并记录了北美落基山脉以西首批对五种ALS抑制剂表现交叉抗性的繁缕种群。研究证实，圣华金谷的三个繁缕种群对标签剂量的mesosulfuron-methyl、pyroxsulam、imazamox、imazethapyr和tribenuron-methyl具有抗性，但抗性水平随种群和除草剂类型而异。遗传分析确认了Trp574Leu点突变介导的靶标位点抗性，与剂量-反应结果一致。建议谨慎使用其他作用机制的除草剂，并采取综合杂草管理策略。