噬菌体编码蛋白PhiP靶向HemA阻断血红素生物合成以抑制细菌生长并促进噬菌体增殖

《Journal of Virology》：Phage-encoded protein PhiP targets HemA to block heme biosynthesis, suppressing bacterial growth and promoting phage propagation

　　

噬菌体编码多种蛋白以劫持宿主代谢从而促进病毒增殖。阐明这些蛋白的功能与机制不仅可深化对噬菌体-宿主相互作用的理解，也为抗菌药物研发提供了新途径。本研究鉴定出PhiP——由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）噬菌体PaoP5编码的一种蛋白，其为细菌生长的强效抑制剂。PhiP的异源表达导致细胞增殖受损及细胞伸长障碍。免疫共沉淀（Co-IP）实验鉴定出HemA——催化血红素生物合成第一步限速反应的谷氨酰-tRNA还原酶——为PhiP的直接互作靶标。机制上，PhiP介导的HemA抑制破坏了血红素生成，导致胞内活性氧（ROS）蓄积、对过氧化氢的敏感性增强以及随后的生长抑制。最后，转录组分析揭示了参与铁摄取和氧化还原稳态的基因发生全局性失调。此外，基于感染的实验证明PhiP在高效噬菌体增殖中发挥重要作用。综上，本研究揭示了噬菌体编码蛋白靶向血红素生物合成以扰乱ROS稳态、抑制细菌生长并促进高效噬菌体增殖的机制。该工作拓展了对噬菌体介导宿主细菌代谢操控的认识，并可能为抗菌治疗新策略提供启示。重要性：多重耐药铜绿假单胞菌是医院获得性感染的主要病因之一，治疗选择有限。噬菌体是抗生素的有前景替代方案，但其蛋白抑制细菌生长的分子机制在很大程度上仍未被探索。本研究鉴定出PhiP——一种靶向血红素生物合成以对铜绿假单胞菌发挥抗菌活性的噬菌体蛋白。该阻断触发细胞内毒性氧复合物的蓄积，从而抑制细胞生长并促进高效噬菌体增殖。该机制不同于以往描述的噬菌体抑制剂（通常靶向细菌细胞的基本结构和功能组分）。重要的是，PhiP靶向HemA——铜绿假单胞菌中一种保守酶，凸显其作为新型抗感染药物骨架的潜力。研究结果拓展了已知的噬菌体-宿主相互作用谱，并为抗菌药物发现提供了新蓝图。

**研究背景与问题**　铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种机会性致病菌，因固有和获得性多重抗生素耐药，对免疫功能低下个体及囊性纤维化患者构成严重威胁。多重耐药菌株的出现促使研究人员重新关注噬菌体疗法。噬菌体作为细菌的天然捕食者，编码多种蛋白以劫持宿主细胞机器促进自身复制与传播，其中部分蛋白特异性抑制细菌生长，是新型抗菌药物开发的候选分子。破坏细菌代谢途径是噬菌体蛋白进行宿主颠覆的尤为有效的策略。血红素生物合成几乎是所有细菌的必需途径，血红素是呼吸、氧化应激防御和电子传递中众多酶的关键辅因子；其第一步限速反应由谷氨酰-tRNA还原酶（HemA）催化，将谷氨酰-tRNA转化为谷氨酸-1-半醛（GSA）。由于HemA的核心地位，其在多个层面受到严格调控，包括血红素反馈抑制和调控性蛋白水解。然而，噬菌体编码蛋白是否直接靶向该途径以抑制细菌生长，此前 largely 未被探索。活性氧（ROS）是有氧代谢副产物，可损伤DNA、蛋白质和脂质；细菌进化出精细防御系统包括ROS清除酶（如过氧化氢酶和过氧化物酶）及协调抗氧化基因表达的调控网络。ROS稳态扰动可导致生长停滞和细胞死亡。近期研究提示某些噬菌体蛋白可能诱导宿主细菌氧化应激作为裂解策略的一部分，但分子机制尚不明确。

**研究开展与结论**　本研究对铜绿假单胞菌噬菌体PaoP5（一种约93 kb的Pakpunavirus，以LPS O-抗原为受体，分离自中国重庆医院污水）编码的抗菌蛋白PhiP（PaoP5_163，命名为噬菌体编码血红素生物合成抑制蛋白）进行了表征。研究人员揭示PhiP直接结合并抑制HemA，从而阻断血红素生物合成；由此导致的血红素耗竭引起胞内ROS蓄积和氧化损伤，最终抑制细菌生长并促进高效噬菌体增殖。这些发现建立了噬菌体介导靶向血红素生物合成与随之而来的氧化还原稳态破坏之间的直接机制联系，为噬菌体与其细菌宿主之间的分子军备竞赛提供了新见解。该研究的重要意义在于：拓展了对噬菌体介导宿主细菌代谢操控的理解；PhiP靶向铜绿假单胞菌中保守的HemA，凸显其作为新型抗感染药物骨架的潜力；为抗菌药物发现提供了新蓝图。

**关键技术方法**　研究人员采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达系统在铜绿假单胞菌PAO1中表达PhiP并进行生长曲线与点板稀释实验；采用免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱（MS）鉴定互作靶标，并以GST pull-down、生物层干涉术（BLI）和细菌双杂交系统验证直接互作；采用RNA-seq转录组分析及基于lux的报告基因实验；采用CRISPR-Cas9系统构建噬菌体phiP敲除突变体（PaoP5ΔphiP），并进行一步生长曲线和噬菌斑实验；采用Heme Assay Kit测定胞内血红素水平，以CM-H2DCFDA探针测定ROS。研究所用噬菌体PaoP5由陆军军医大学舒磊教授提供。

**研究结果**　*PhiP抑制铜绿假单胞菌生长*：将phiP基因克隆至IPTG诱导表达载体并导入PAO1，随IPTG浓度增加，PhiP表达导致剂量依赖性生长抑制，0.5 mM IPTG时生长几乎完全停滞，基于12 h生长计算EC??约为0.03–0.05 mM；PhiP-Flag标签蛋白具有相同抗菌效果，生长抑制程度与PhiP产量正相关；固体培养基点板稀释实验显示PhiP表达严重损害集落形成。表明PhiP是铜绿假单胞菌的强效生长抑制剂。*PhiP抑制细胞伸长*：显微镜观察显示对照细胞呈典型杆状且正常伸长，而产PhiP细胞显著变短且未能正常伸长，定量分析证实平均细胞长度显著降低，提示PhiP可能干扰细胞生长分裂所需的基本过程。*PhiP靶向多种细菌蛋白*：Co-IP结合质谱鉴定出与PhiP-Flag特异性共纯化的多种细菌蛋白，包括DnaK（分子伴侣蛋白）、HslU（HslUV蛋白酶复合体的ATPase组分）、HemA和GcpE（参与类异戊二烯生物合成的酶）。GST pull-down证实His-HemA在GST-PhiP pull-down中被特异性保留而不在GST对照中，BLI测得解离常数（KD）为4.263 ± 0.343 μM，细菌双杂交进一步证实PhiP与HemA直接结合；PhiP与HslU、GcpE的直接互作亦经GST pull-down验证，而DnaK作为已知通用伴侣蛋白被排除；后续功能分析提示这些互作可能对PhiP生长抑制表型无显著贡献。*PhiP通过直接结合HemA介导生长抑制*：共表达HemA完全消除PhiP在固体培养基上的生长抑制并恢复集落形成，而过表达GcpE或HslU不能挽救；HemA共表达恢复PhiP产细胞的正常细胞伸长，液体培养基中PhiP介导的生长抑制被HemA共表达完全逆转；Heme Assay Kit检测显示PhiP表达确实降低血红素合成，HemA共表达逆转该抑制效应。表明HemA是PhiP抑制细菌生长和细胞分裂的关键功能靶标。*PhiP通过抑制血红素合成扰乱ROS稳态抑制细菌生长*：补充HemA下游产物5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）或外源血红素均完全逆转PhiP的生长抑制作用，表明PhiP主要作用于耗竭血红素生物合成途径而非脱靶毒性效应；CM-H2DCFDA探针检测显示产PhiP细胞荧光显著高于对照，证实血红素合成抑制导致ROS蓄积；纸片扩散实验显示产PhiP细胞对过氧化氢形成显著更大的抑菌圈，即对氧化应激超敏，而过表达HemA可挽救该超敏性；过表达ROS清除蛋白OxyR（过氧化物传感器和调控因子）或KatA（过氧化氢酶）增强产PhiP细胞对过氧化氢的耐受性；补充ROS清除剂硫脲恢复产PhiP菌株的氧化剂抗性，进一步证实生长缺陷归因于氧化应激。*PhiP调控通路的全局转录组分析*：RNA-seq显示PhiP表达引起广泛基因表达变化，1296个基因显著差异表达（P < 0.05，|log2FC| > 1）；GO富集分析显示受影响最显著的途径与铁摄取、铁载体生物合成、氧化还原稳态和应激反应相关；参与呼吸的基因（包括细胞色素氧化酶、血红素生物合成、钼辅因子合成和反硝化）强烈上调，可能代表对血红素耗竭的代偿反应；基于lux的报告基因实验证实norBC（编码一氧化氮还原酶）和nirQ（参与反硝化）启动子活性在产PhiP细胞中显著升高，证实PhiP表达触发与氧化应激和代谢扰动一致的转录程序。*PhiP在噬菌体增殖中发挥关键作用*：比较IPTG诱导与PaoP5感染下phiP表达，IPTG诱导以剂量依赖方式增加phiP mRNA水平，而PaoP5感染导致更高表达，提示感染是比IPTG更强的phiP诱导因素；由于hemA可能为必需基因且多次尝试构建存活ΔhemA突变体未成功，研究人员以天然hemA转录水平作为读出；感染后phiP转录逐渐上调，20 min时达峰，而hemA转录在整个感染过程中基本不变；利用CRISPR-Cas9系统构建PaoP5ΔphiP突变体，感染PaoP5ΔphiP的细胞血红素水平高于感染野生型PaoP5的细胞，表明PhiP在感染期间抑制血红素蓄积；吸附实验显示PaoP5与PaoP5ΔphiP对PAO1的吸附效率无显著差异，表明PhiP不影响初始噬菌体附着；一步生长曲线显示感染后40 min起PaoP5滴度显著高于PaoP5ΔphiP；噬菌斑实验显示PaoP5ΔphiP形成的噬菌斑少于野生型噬菌体。表明PhiP在噬菌体感染期间高表达、调节宿主血红素代谢并在高效噬菌体增殖中发挥重要作用。*PhiP同源物在假单胞菌噬菌体中广泛分布*：以PhiP为查询序列对NCBI非冗余蛋白序列数据库进行BLASTp搜索，鉴定出17个PhiP样同源物，几乎全部由假单胞菌噬菌体编码，包括来自ITTPL、HHBS18_1、vB_PaeM_MAG1、IQPL、SPA01等的假设蛋白，具有显著序列相似性；值得注意的是，在远缘相关细菌Cronobacter malonaticus和Methylobacter psychrophilus中也发现同源物，提示该基因可能在不同细菌属间发生水平转移；近缘噬菌体同源物间的氨基酸序列一致性显著高于远缘细菌对应物，提示phiP是与假单胞菌噬菌体特异性相关的保守基因，可能在噬菌体-宿主互作中发挥共通且重要的作用。*PhiP的抑制机制模型*：基于以上实验证据，研究人员提出PhiP作用的详细分子模型：噬菌体PaoP5感染铜绿假单胞菌后，宿主蛋白合成系统产生PhiP；PhiP直接结合血红素生物合成限速酶HemA并抑制其活性，阻断血红素生成，损害参与呼吸和氧化应激防御的血红素酶功能；随之胞内ROS蓄积，对DNA、蛋白质和脂质造成氧化损伤，抑制细菌生长和分裂。因此PhiP作为一种强效分子武器颠覆细菌血红素代谢，将该破坏与氧化应激和生长抑制联系起来。

**讨论与结论**　噬菌体编码众多蛋白重编程宿主细菌代谢，营造有利于病毒增殖的细胞环境。本研究鉴定并表征了PhiP——铜绿假单胞菌噬菌体PaoP5编码的一种此前未表征蛋白——为细菌生长的强效抑制剂，建立了噬菌体介导靶向血红素生物合成与破坏胞内ROS稳态之间的直接机制联系。与以往表征的噬菌体编码生长抑制剂相比，PhiP机制较为独特：许多噬菌体蛋白靶向细菌细胞壁（如裂解酶）、DNA复制机器或蛋白质合成，而靶向血红素生物合成途径中的代谢酶代表一种独特策略。值得注意的是，枯草芽孢杆菌噬菌体SPO1蛋白Gp49（一种RNA结合蛋白）上调宿主血红素合成以捕获胞质铁促进噬菌体发育，与通过结合HemA抑制血红素合成的PhiP不同，凸显噬菌体重编程宿主代谢的显著进化适应性。此外，PaoP5本身还编码Dap1、Dap2和PavP等蛋白，在生长抑制和毒力调节中展现多样功能，提示PaoP5采用多蛋白策略经多途径颠覆宿主。PhiP诱导的ROS蓄积导致生长抑制，这与许多杀菌剂（包括某些抗生素）至少部分通过ROS介导损伤杀灭细菌的新兴概念一致；然而抗生素介导的ROS产生通常是多种代谢破坏的下游后果，而PhiP似乎通过血红素合成中特异且直接的阻断触发ROS蓄积，这种特异性可能为噬菌体提供优势，允许精确时序控制宿主生长抑制而不必立即裂解。免疫细胞ROS触发Gifsy-1末端酶片段化tRNALeu、短暂停滞沙门菌翻译和生长，是噬菌体介导生长抑制与氧化应激相关的另一例证。转录组分析显示PhiP表达导致铁摄取基因下调，这可能是血红素耗竭的代偿反应；相反，norBC和nirQ等氧化还原响应基因上调反映细胞对抗氧化应激的尝试；转录变化与血红素缺乏和氧化挑战的生理状态一致。PhiP同源物在多种假单胞菌噬菌体中的广泛分布提示靶向HemA代表噬菌体-宿主互作中的保守策略。研究结论（翻译）：总之，本研究揭示了一种新机制，即噬菌体编码蛋白破坏细菌血红素生物合成和氧化还原稳态以抑制宿主生长并促进病毒增殖；该工作拓展了对噬菌体-宿主代谢相互作用的理解，并可能为抗菌治疗启发新方法。未来需进一步研究：PhiP结合抑制HemA酶活性的精确分子细节需结构和生化研究；尽管HemA介导生长抑制，PhiP与GcpE和HslU结合的生物学相关性仍不清楚，可能涉及应激反应或蛋白周转；PhiP介导生长抑制在复杂环境噬菌体感染中的体内相关性有待研究，鉴于其强效抗菌活性，PhiP-HemA界面值得探索以开发靶向血红素生物合成的新型抗菌药物。