SARS-CoV-2 Nsp2通过重编程宿主免疫驱动致病性炎症

《Journal of Virology》：SARS-CoV-2 Nsp2 reprograms host immunity to drive pathogenic inflammation

　　

尽管COVID-19大流行已经结束，SARS-CoV-2仍在地方法流行中传播，凸显了进一步了解病毒致病决定因素的必要性。非结构蛋白2（Nsp2）的推定功能已在体外研究中探索，但Nsp2在体内如何影响致病性和整体病毒适应性尚未得到证实。在此，研究人员生成了一种缺少Nsp2的重组SARS-CoV-2（ΔNsp2），以研究其在病毒复制和疾病中的作用。虽然ΔNsp2在体外和体内的复制与野生型病毒相当，但其缺失导致K18-hACE2小鼠的疾病显著减弱。野生型病毒感染诱导强烈的促炎反应，伴随单核细胞和巨噬细胞招募增加，而ΔNsp2病毒感染则促进了更平衡的抗病毒反应，其特征是淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞招募增强。这伴随着肺部和全身炎症的减轻以及不同的转录程序，包括RNA加工和翻译相关通路的下调。机制上，紫外交联免疫沉淀测序（CLIP-seq）和邻近标记实验提示，Nsp2与宿主RNA及翻译机器组分相互作用。总之，这些发现将Nsp2鉴定为通过扭曲宿主免疫反应驱动免疫病理学的关键毒力因子，突显了其作为宿主-病原相互作用调节因子的作用。

严重COVID-19以失调的炎症反应为核心特征，但驱动这种病理性免疫激活的病毒决定因素仍不明确。SARS-CoV-2基因组编码16种非结构蛋白（Nsps），其中多种蛋白已被证明可调节宿主先天免疫信号。Nsp2在冠状病毒间序列变异较大，体外研究提示其参与免疫调节，然而其在体内对致病性和病毒适应性的贡献一直缺乏直接证据。为此，研究人员利用反向遗传系统构建了完全缺失Nsp2编码序列的重组SARS-CoV-2（ΔNsp2），系统比较了其与野生型（WT）病毒在体外复制、体内致病性及宿主免疫应答中的差异。结果显示，ΔNsp2在体外和体内的复制能力与WT病毒相当，但在K18-hACE2小鼠中，ΔNsp2感染导致疾病显著减毒，存活率大幅提高，肺部和全身炎症明显减轻。机制研究表明，Nsp2可通过结合宿主RNA及翻译机器组分来调节宿主基因表达，从而将免疫应答导向促炎病理方向。这些发现将Nsp2确立为SARS-CoV-2的关键毒力因子，揭示了非必需病毒蛋白如何塑造疾病严重程度，也为靶向炎症而非单纯抗病毒的干预策略提供了新思路。

研究人员采用的主要技术方法包括：基于酵母人工染色体（YAC）和转化相关重组（TAR）的反向遗传系统，用于生成重组Wuhan-like SARS-CoV-2（WT和ΔNsp2）；使用K18-hACE2转基因小鼠（B6.Cg-Tg(K18-hACE2)2Prlmn/J，9周龄雄性和雌性；生存实验每组7只，组织分析每组5只）进行体内感染模型；利用反转录微滴数字PCR（RT-ddPCR）和反转录定量PCR（RT-qPCR）定量病毒RNA；通过RNA测序（RNA-seq）分析肺组织转录组；采用流式细胞术对肺和外周血免疫细胞进行精细分型；结合组织学与免疫组化评估肺部病理和病毒抗原分布；运用紫外交联免疫沉淀测序（CLIP-seq）和邻近生物素化（BioID）鉴定Nsp2相互作用的RNA和蛋白质。

**结果部分**

**ΔNsp2突变体在体外与WT SARS-CoV-2复制动力学相当**：在A549-hACE2细胞、Vero细胞及气液界面分化的A549细胞中，ΔNsp2与WT病毒的RNA表达动力学和感染性子代病毒产生能力总体相当，表明Nsp2对病毒复制并非必需。

**ΔNsp2突变病毒在K18-hACE2小鼠中表现减毒表型**：ΔNsp2感染小鼠大部分存活至实验终点，而WT感染组仅约14%存活；ΔNsp2组临床评分显著降低，肺部感染性滴度虽无显著差异，但病毒N蛋白水平和肺组织损伤面积在感染早期明显低于WT组，提示Nsp2缺失在不影响病毒载量的情况下减轻了病理损伤。

**野生型SARS-CoV-2感染诱导肺部更强的炎症反应**：WT感染小鼠肺内CCL2、CXCL9、IFN-γ、CXCL1、CCL3和IL-6等促炎介质显著升高，而ΔNsp2感染小鼠肺内CCL5（T细胞相关趋化因子）水平更高；组织学分析显示WT感染导致血管周围、支气管周围和实质区域更严重的炎症浸润。

**野生型或ΔNsp2 rSARS-CoV-2感染后肺部白细胞群体的差异调节**：流式细胞术显示，ΔNsp2感染小鼠肺内T辅助细胞、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和B细胞比例增加，NK细胞更丰富；而WT感染小鼠单核细胞比例持续升高，且Th1细胞比例更高，提示Nsp2将免疫应答推向促炎性的单核细胞/巨噬细胞主导模式。

**野生型或ΔNsp2 rSARS-CoV-2感染后肺部抗原呈递细胞群体的变化**：WT感染小鼠肺内经典树突状细胞（cDC）和浆细胞样树突状细胞（pDC）比例更高，而ΔNsp2感染小鼠中间质巨噬细胞、巨核细胞及CD11c⁺BST2⁺Ly6C⁺单核细胞上MHCII表达增加，表明Nsp2缺失使抗原呈递向替代性髓系细胞转移，可能促进更有效的T细胞应答。

**ΔNsp2感染引发外周血强效抗病毒反应，而野生型rSARS-CoV-2促进促炎全身特征**：WT感染小鼠血浆中炎症介质反应更早更强，并出现外周T细胞耗竭、单核细胞和中性粒细胞比例升高；ΔNsp2感染小鼠则表现为B细胞和NK细胞比例增加，且早期出现更高比例的PD-L1⁺中性粒细胞，提示一种免疫调节/保护性表型。

**Nsp2缺失改变SARS-CoV-2感染的早期肺转录反应**：RNA-seq分析显示，感染后3天WT和ΔNsp2小鼠肺转录组已明显分离；与WT相比，ΔNsp2感染中差异表达基因以下调为主，且两个感染组与模拟感染组相比差异基因集合高度重叠，表明Nsp2缺失并非主动抑制转录程序，而是整体减弱感染诱导的基因表达强度。

**ΔNsp2感染与延迟且不同的转录程序相关**：基因集富集分析（GSEA）显示，DNA损伤反应和表观遗传调控相关通路在ΔNsp2感染早期（3–5天）下调、后期（7天）上调，表现为应答延迟；而RNA加工、翻译及急性肺损伤/炎症相关通路在ΔNsp2感染中持续下调，与减毒的炎症表型一致。

**Nsp2可能通过RNA结合调节翻译**：CLIP-seq显示，Nsp2结合的宿主RNA显著富集于翻译调控和RNA沉默相关基因；邻近生物素化实验进一步提示Nsp2可与核糖体蛋白及剪接体组分相互作用，支持Nsp2通过影响宿主翻译和RNA加工来促进病毒致病性的假说。

**讨论与结论**：讨论指出，Nsp2缺失对病毒复制无显著影响，但可改变病毒RNA和蛋白（如E蛋白）的表达模式，进而影响与TLR2等炎症信号通路的交互；ΔNsp2感染小鼠中IL-6和IFN-γ水平降低，与人类重症COVID-19中促炎细胞因子升高的现象相呼应。Nsp2缺失还导致肺和外周血中淋巴细胞比例增加，减轻病毒诱导的淋巴细胞减少，并改变抗原呈递细胞格局，提示Nsp2通过抑制有效抗病毒免疫、促进单核细胞/巨噬细胞驱动的过度炎症来加剧疾病。结合CLIP-seq和邻近生物素化结果，Nsp2可能通过与宿主翻译机器直接互作来重编程宿主基因表达。研究结论可概括为：SARS-CoV-2 Nsp2是驱动体内免疫病理的重要毒力因子，其缺失在保持病毒复制能力的同时显著减弱疾病严重程度，将肺部和全身炎症转向更平衡的抗病毒应答；Nsp2通过调节RNA加工和翻译相关通路影响宿主反应，这一发现为理解宿主-病原相互作用以及开发针对COVID-19严重炎症的治疗策略提供了新视角。