《Briefings in Bioinformatics》：Identifying multi-omics spatial domains via masked autoencoder and diffusion-based latent regularization with SpaMEDM
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空间多组学数据为组织组织学提供了互补的分子视角。然而，由于数据稀疏性、技术噪声以及模态特异性分布，其整合仍具挑战性。在此，研究人员提出空间掩码自编码器与基于扩散的模型（Spatial Masked autoEncoder and Diffusion-based
空间多组学数据为组织组织学提供了互补的分子视角。然而，由于数据稀疏性、技术噪声以及模态特异性分布，其整合仍具挑战性。在此，研究人员提出空间掩码自编码器与基于扩散的模型（Spatial Masked autoEncoder and Diffusion-based Model, SpaMEDM），这是一种端到端图表示学习框架，其在双重注意力图整合骨干网络上增强了掩码重建与基于扩散的潜在噪声预测正则化。在掩码轨迹中，随机掩码的斑点（spot）特征通过利用模态特异性和图特异性邻域信息进行恢复。与此同时，对模态特异性潜在表示在随机采样的噪声水平上施加高斯扰动，并训练一个空间图信息网络来预测注入的噪声。该基于扩散的目标仅在训练期间使用，以增强对潜在扰动的鲁棒性，而非在推理期间执行迭代逆向扩散或采样。此外，基于余弦的配对斑点方向对齐和邻接重建促进了跨模态表示的兼容性以及所选图结构的保持。SpaMEDM灵活支持纯空间、双重特征–空间以及模态特异性特征修剪的空间图配置。在多样化的空间多组学数据集上的评估证明了其具有竞争力的空间域识别性能，并产生有助于下游探索性分析的整合嵌入。
**研究背景与问题**
随着组学技术的不断发展，研究已从单细胞转录组学过渡到空间转录组学，并迈入空间多组学时代。空间多组学数据使研究人员能够在空间和时间维度上利用不同组学层的数据探索生物系统的分子调控网络、细胞异质性及免疫微环境特征。每种组学数据提供窥探细胞或组织生物学功能的独特视角，因此多模态方法具有强大潜力。然而，有效整合这些多组学数据并开展各类分析已成为重大挑战。通用单细胞分析框架如Seurat和Scanpy虽提供数据预处理、整合、降维和可视化的丰富功能，但其标准多模态分析流程不会自动将空间坐标纳入表示学习目标，因而促使空间显式整合方法的发展。基于深度学习的方法提供了学习非线性多组学表示的灵活替代方案。scMDC和scMIC等方法聚焦单细胞多组学分析，利用自编码器获得低维嵌入用于聚类。totalVI、MultiVI和MOFA+等非空间多组学整合方法亦被提出。这些方法推动了多组学整合分析的发展，但并非专门设计用于将空间信息纳入多组学整合。GraphST、SpaceFlow、SpaGCN和stHGC等方法将组学数据与空间位置整合，部分利用位置信息平滑识别的空间域并缓解噪声，但这些方法主要针对单模态空间转录组学开发和评估，未提供整合互补空间组学模态的显式机制。现有的空间多组学整合方法包括SpaMultiVAE、SpatialGlue、SSGATE、PRAGA、COSMOS、SpaLLM、SpaMICS、CANDIES和SpaDDM。SpaMultiVAE利用VAE模块处理不同组学模态的拼接表示，但有观点认为该设计限制了各模态特异性特征的有效利用。SpatialGlue是早期专为空间多组学数据域识别设计的方法，利用图卷积网络通过共享邻接矩阵或不同特征图融合各模态特征。SSGATE根据数据类型构建特征图或空间图，采用编码器-解码器架构训练模型。PRAGA基于类似SpatialGlue的框架改进了空间信息的自适应聚合，但随着细胞数量增加将消耗更多运行时间和内存。COSMOS实现双通道Deep Graph Infomax模型结合加权最近邻提取互补跨模态特征。SpaLLM利用预训练大语言模型编码组学数据，但依赖外部组件而非完全端到端训练的流程。SpaMICS采用一致性和特异性深度子空间学习捕获跨组学模态的互补信息，但主要输出亲和矩阵而非斑点级低维嵌入，限制了基于嵌入的可视化应用。CANDIES采用条件扩散结合对比学习实现显式跨模态去噪和整合。SpaDDM同样利用扩散机制构建有向图扩散模型实现空间信息引导的跨模态联合嵌入，但其直接在PCA降维特征上执行扩散，同时使用扩散网络进行特征提取，将扩散过程与PCA降维特征的表示提取直接耦合。此外，鉴于空间多组学数据在分辨率、噪声水平和生物学特征方面的显著异质性，广泛依赖单一图拓扑仍是一个关键局限性。当前方法倾向于僵化地采用纯空间图或预定义的特征–空间图，而不考虑底层数据特征。为解决这些挑战，研究人员提出SpaMEDM，一种端到端空间多组学表示学习框架，结合掩码重建与基于扩散的潜在噪声预测正则化。SpaMEDM构建于双重注意力图整合骨干网络之上，引入非对称双轨训练方案。掩码轨迹利用图聚合的局部信息重建随机隐藏的斑点特征，促使嵌入保留对损坏输入具有预测性的信息。与此同时，模态特异性潜在嵌入在随机采样的噪声水平上受到高斯噪声扰动，训练空间图信息预测器估计注入的噪声。与近期基于扩散的方法不同，SpaMEDM将该目标作为辅助训练正则化器，旨在提高对潜在扰动的鲁棒性，不涉及推理期间的迭代逆向扩散或采样。配对斑点余弦对齐鼓励跨模态的方向兼容性，邻接重建促使掩码融合嵌入保持所选图编码的关系。此外，SpaMEDM支持纯空间、双重特征–空间和模态特异性特征修剪的空间图配置，以适应不同的组织结构与组学特征。在多样化空间多组学数据集上的评估表明，SpaMEDM在空间域识别、低维可视化及其他下游生物学分析中具有竞争力。
**关键技术方法**
研究人员采用以下关键技术方法（忽略试剂和具体培养、质粒构建操作步骤）：(1) 对每种模态应用PCA算法（表观基因组模态使用潜在语义索引LSI）获得初步表示，并利用KNN算法基于表示和共享空间坐标构建特征图和空间图；(2) 构建双重注意力图整合骨干网络，包括模态特异性和图特异性编码器（基于GCN）、模态间注意力和模态内注意力以及模态特异性解码器；(3) 掩码自编码器与图邻接保持轨迹，随机掩码部分斑点特征并利用Scaled Cosine Error作为重建损失，同时使用图邻接保持损失；(4) 基于扩散的潜在噪声预测正则化轨迹，在随机采样噪声水平上对模态特异性潜在表示注入高斯噪声，训练空间图信息噪声预测器估计注入噪声，该目标仅用于训练阶段；(5) 跨模态方向对齐，利用余弦相似度进行样本级方向对齐；(6) 联合优化四个损失函数进行端到端训练，推理时禁用掩码和扩散轨迹，通过单次前向传播获得整合嵌入。研究使用的数据集来源包括：MISAR-seq小鼠胚胎脑数据集和人淋巴结D1样本（Zenodo: 15681100）；人淋巴结A1样本、小鼠脾脏数据集、P22小鼠脑Spatial ATAC–RNA-seq和Spatial CUT&Tag-RNA-seq数据集（Zenodo: 10362607）；Spatial-CITE-seq人类扁桃体数据集（Zenodo: 13932144）；Slide-tags人类黑色素瘤单细胞RNA–ATAC数据集（Broad Institute Single Cell Portal: SCP2176）；小鼠脑RNA–代谢组学数据集（Google Drive）。
**研究结果**
**SpaMEDM概述**：SpaMEDM构建于双重注意力图整合骨干网络之上，包括模态和 Graph 特异性编码器、模态间注意力、模态内注意力和模态特异性解码器。SpaMEDM通过非对称训练公式扩展该骨干网络，结合掩码局部上下文重建、图信息潜在噪声预测正则化、配对斑点跨模态方向对齐和邻接模式保持。对生物组织进行空间多组学测序通常产生两种不同的组学数据模态及共享空间位置信息。通过两条轨迹处理表示和图：掩码自编码器和图邻接重建轨迹，以及基于扩散的潜在噪声预测正则化轨迹。推理时，掩码和扩散正则化均被禁用，通过编码器和注意力模块的单次前向传播获得整合表示。通过该概述性研究，描述了SpaMEDM的整体架构和训练/推理流程。
**SpaMEDM在MISAR-seq小鼠胚胎脑数据集上提升空间域识别性能**：研究人员首先将SpaMEDM应用于MISAR-seq E15.5小鼠胚胎脑空间RNA–ATAC数据集（包含1949个斑点、32285个RNA和141420个峰）。组织分为12个区域。SpaMEDM取得最高性能（ARI: 0.66, NMI: 0.68），其次是PRAGA（ARI: 0.54, NMI: 0.63）和SpatialGlue（ARI: 0.50, NMI: 0.56）。SpaMEDM识别了更完整的软骨域，并将间脑和后脑识别为单一整合区域。相比之下，SSGATE、COSMOS和SpaDDM未能分离DPallm和DPallv域。在七次运行中，SpaMEDM保持优越的平均性能（ARI: 0.6122, NMI: 0.6197）。UMAP可视化显示SpaMEDM呈现连续的低维排列。注意力权重小提琴图揭示学习到的注意力权重呈现簇特异性分布。差异基因表达分析鉴定了多个高表达域与SpaMEDM识别的空间域密切匹配的基因，包括Lingo2、Ntng1、Nrxn3、Ttn、Myh3、Tfap2b、Col1a2、Neurod2、Neurod6和Pax6。GO富集分析发现DPallm域主要与神经元成熟相关，而DPallv域富集于干细胞增殖和干性维持。通过该数据集研究，证明了SpaMEDM在空间域识别中的优越性能及下游生物学分析能力。
**SpaMEDM在人类淋巴结数据上的结果揭示图构建方法影响识别结果**：研究人员将SpaMEDM应用于人类淋巴结数据集。A1样本包含3484个斑点、18085个RNA和31种蛋白质。SpaMEDM取得最优域识别性能（ARI: 0.36, NMI: 0.43），scMIC次之（ARI: 0.34, NMI: 0.39），但scMIC变异性更高。SpaMEDM进一步细分了皮层域。空间自相关分析显示包膜周围脂肪组织（Cluster 6）具有高度空间聚集性。在D1样本中，SpaMEDM同样优于其他方法（ARI: 0.35, NMI: 0.42）。通过比较完整空间图与修剪空间图的配置，发现虽然定量指标下降不大，但识别结果呈现显著定性变化，表明同组织类型样本仍可表现出不同水平的空间异质性，不存在普遍最优的图配置。通过该研究，证明了SpaMEDM在不同图配置下的灵活性和对组织异质性的适应能力。
**SpaMEDM在人类扁桃体数据集上取得有竞争力的空间域识别性能**：研究人员将SpaMEDM应用于Spatial-CITE-seq人类扁桃体RNA–蛋白质多组学数据集（包含2492个斑点、984个RNA和283种蛋白质）。SpaMEDM、SSGATE和COSMOS产生更平滑的识别结果，而SpatialGlue、SpaMultiVAE和PRAGA表现出不同程度的噪声。SSGATE未能捕获完整的GC暗区，而SpaMEDM揭示了GC内的不同层次（Clusters 7、4和2）。蛋白质差异分析鉴定了多个高表达区域与空间域密切匹配的蛋白质，包括CD35、CD21、CD10、CD55、CD324、CD3、IgD、CD66b和CD9。通过该研究，证明了SpaMEDM能够捕获关键标志物并在空间RNA–蛋白质多组学数据中识别具有生物学意义的空间域。
**SpaMEDM可扩展至人类黑色素瘤单细胞多组学数据分析**：研究人员将SpaMEDM应用于Slide-tags人类黑色素瘤单细胞多组学数据集（包含2535个细胞、36601个RNA和53451个峰）。SpaMEDM取得最佳细胞聚类性能（ARI: 0.87, NMI: 0.85），其次是scMIC（ARI: 0.78, NMI: 0.79）。Sankey图显示SpaMEDM对CD8 T细胞、两个肿瘤细胞群体、单核–巨噬谱系和浆细胞簇具有优越的聚类能力，且在区分极稀有pDC群体方面表现良好。差异表达基因热图显示两个肿瘤细胞群体（Clusters 3和5）表现出大量高表达基因。峰–基因分析鉴定了两个肿瘤细胞群体和单核–巨噬谱系细胞（Cluster 8）中众多具有簇特异性表达和染色质可及性模式的显著峰–基因关联。通过该研究，证明了SpaMEDM不仅适用于空间多组学数据，也适用于单细胞水平，其灵活的图配置增强了聚类性能并解析了复杂细胞亚群。
**讨论与结论**
本研究介绍了SpaMEDM，一种双轨深度学习框架，旨在解决空间多组学整合的内在挑战，包括高数据稀疏性、模态异质性和空间噪声。通过结合掩码自编码器与基于扩散的正则化，SpaMEDM利用邻近斑点的图聚合信息有效重建掩码斑点特征，同时利用基于扩散的目标惩罚图信息噪声预测误差。模态内和模态间注意力机制与基于余弦的跨模态方向对齐相结合，使SpaMEDM能够自适应融合多模态信息，同时约束配对表示的角度一致性而不显式匹配其向量幅度。研究人员还在小鼠脑空间RNA–代谢组学数据集和小鼠脾脏RNA–蛋白质数据集上测试了模型，并在更多组学类型和生物组织上验证了空间域识别能力。参数敏感性研究验证了推荐默认参数组合，模块消融和扰动鲁棒性研究评估了各组件的作用。SpaMEDM最初专为双视图模式设计，但在测试P22小鼠脑数据集后发现纯空间图模式可大大缓解问题，促使研究人员研究不同生物组织空间多组学数据的图构建策略选择。系统评估表明没有单一配置在所有数据集上始终达到最优性能。双重特征–空间图被推荐为初始默认配置，替代配置适用于某一图源被认为不可靠的数据集。图模式选择仍是用户控制的建模选择。未来工作将研究数据驱动的图学习或无需先验的模型选择程序。关于计算效率，SpaMEDM的主要计算瓶颈来自图邻接重建和后续谱聚类过程。SpaMEDM在 varying 斑点数量的数据集上表现出中等计算时间效率，但与SpaMultiVAE、SSGATE和PRAGA等方法相比大幅减少运行时间，同时需要更少的GPU内存消耗。由于图邻接重建损失和聚类后处理步骤，时间复杂度按O(N2)扩展。在本研究硬件上，SpaMEDM成功评估了包含多达40000个斑点的扩展基准，训练–聚类运行时间为37分钟，峰值GPU内存消耗约53 GB。未来可探索多种策略进一步提高可扩展性，包括用基于边的正采样匹配负对替代完整邻接重建目标、邻居采样小批量、图划分或基于空间补丁的重叠边界区域训练。本研究结论为：SpaMEDM通过结合掩码自编码器与基于扩散的正则化，有效应对空间多组学整合中的数据稀疏性、模态异质性和空间噪声挑战，在多样化空间多组学数据集上展现出竞争性的空间域识别性能，并提供灵活的图配置方案以适应不同组织结构与组学特征。
