无细胞格氏乳杆菌提取物对AGS胃癌细胞代谢抑制的体外评估

《Cancer Treatment and Research Communications》：In vitro Assessment of Metabolic Inhibition in AGS Gastric Cancer Cells Treated with Cell-Free Lactobacillus gasseri Extract

　　

本研究旨在对无细胞格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）提取物作用于AGS胃腺癌细胞后的代谢效应进行初步体外评估。采用MTT还原法作为细胞代谢活性指标，而非细胞活力或细胞毒性指标。AGS细胞经7.81–500 μL/mL七个浓度梯度的无细胞提取物分别处理24、48和72 h。结果显示，相对代谢活性呈浓度依赖性和暴露时间依赖性下降，24 h时从7.81 μL/mL的87%降至500 μL/mL的16%；48 h时在250–500 μL/mL接近约5%；72 h时各浓度均产生50–96%的降低，500 μL/mL时低于5%。采用四参数逻辑（4PL）非线性回归估算的IC₅₀值分别为24 h 44.7 μL/mL（95% CI：38.9–51.8）、48 h 21.9 μL/mL（95% CI：18.2–25.7）和72 h 7.8 μL/mL（95% CI：6.5–9.1），IC₅₀随暴露时间延长而降低。相差显微镜观察到与浓度相关的形态学改变，但仅凭形态学不能确立细胞死亡或细胞毒性。由于未充分记录仅含提取物的空白孔，不能排除MTT检测干扰；高浓度提取物占处理体积比例较高（可达50%，v/v），可能改变培养基组成。因此，上述结果应严格解释为代谢抑制，而非细胞毒性、抗癌活性或治疗效力。尚需进一步研究确认细胞毒性、鉴定活性成分并评估选择性。

**研究背景与问题** 胃癌仍是全球重大公共卫生问题。据国际癌症研究机构（IARC）GLOBOCAN 2020报告，胃癌居全球最常见诊断癌症第五位、癌症相关死亡第四位。胃腺癌起源于胃浅表黏膜上皮细胞，是主要组织学亚型，因诊断晚、治疗选择有限而预后较差。尽管诊疗策略有所进步，生存结局仍不理想，亟需新型预防和治疗手段。近年来，益生菌尤其乳杆菌属（Lactobacillus） species因潜在抗癌特性受到关注。益生菌在维持胃肠道稳态、调节肠道菌群、增强肠道蠕动和减少膳食致癌物暴露方面发挥重要作用。多项研究表明乳杆菌可抑制癌细胞增殖、抑制迁移并通过多种机制诱导凋亡。例如，乳杆菌菌株通过上调E-钙黏蛋白（E-cadherin）对宫颈癌细胞发挥强细胞毒性作用，从而抑制细胞迁移；在结直肠癌模型中，益生菌来源代谢物可诱导凋亡、使细胞周期阻滞于S期并抑制HT-29和LT-97等细胞系增殖。益生菌与幽门螺杆菌（H. pylori）——胃癌发生的主要危险因素——之间的相互作用进一步凸显其治疗相关性。特定乳杆菌菌株可减少H. pylori对胃上皮细胞的黏附、干扰其定植并减轻感染诱导的炎症。其中，格氏乳杆菌（L. gasseri）因能在AGS胃腺癌细胞中下调BCL-2、β-连环蛋白（β-catenin）、整合素α5和整合素β1等致癌和炎症介质而尤受关注。重要的是，此类研究中观察到的MTT信号降低反映的是代谢活性下降，而非已确认的细胞毒性或凋亡。传统发酵食品也是益生菌微生物的丰富来源。浆水是中国西北地区传统发酵植物性食品，含包括乳杆菌和醋酸杆菌（Acetobacter）在内的多样微生物群落；浆水来源的无细胞提取物及分离的乳杆菌菌株对结肠癌细胞增殖表现出强抑制作用。其他证据支持其他益生菌种的抗癌潜力：干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus casei）LH23可逆转宫颈癌细胞的恶性特征，而植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）产生的胞外多糖（EPS）可调节GLUT-4、Akt-2和AMPK等代谢信号通路。尽管益生菌已在癌症模型中被研究其潜在生物学效应，但现有证据仍属初步且多限于体外研究，其在胃癌中的治疗相关性尚未确立，机制理解亦不完整。鉴于上述考虑，本研究旨在对无细胞L. gasseri提取物作用于AGS细胞的代谢效应进行初步体外评估。本工作不评估治疗效力，也不应被解释为临床应用的证据。

**研究方法** 本研究不涉及人体参与者或动物受试者。AGS细胞在BSL-2条件下操作，L. gasseri在BSL-1规程下操作。AGS人胃腺癌细胞获自伊朗巴斯德研究所，培养于补充10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素–链霉素和1% L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中，于37 °C、5% CO?加湿培养箱中维持，常规于70–80%汇合度传代。代谢活性实验中将AGS细胞以1 × 10?个/孔接种于96孔板，过夜贴壁，处理时达70–80%汇合度，24、48或72 h孵育期间不更换培养基以维持一致暴露条件。L. gasseri ATCC 33323于37 °C厌氧条件下在de Man–Rogosa–Sharpe（MRS）肉汤中培养24 h，培养物以4000 rpm于4 °C离心10 min，收集上清并经无菌0.22 μm PES膜过滤获得无细胞提取物，天然pH（4.2 ± 0.1）用无菌1 N NaOH调至pH 7.0，提取物于4 °C保存并在48 h内使用。为确认无活菌，将100 μL过滤提取物涂布MRS琼脂并于37 °C厌氧孵育72 h，各重复（n = 3）均未观察到生长，三个独立提取批次均重复无菌检测。提取物理化特征包括：pH 4.2 ± 0.1、中和后pH 7.0、蛋白浓度0.82 ± 0.05 mg/mL、总可溶性代谢物3.1 ± 0.2 °Brix、渗透压285 ± 10 mOsm/kg；各工作浓度（7.81–500 μL/mL）稀释入完全RPMI-1640培养基后测定终pH、渗透压、蛋白含量和°Brix，所有处理条件均处于生理pH（6.95–7.05）和渗透压（285–305 mOsm/kg）范围。中和前后提取物在蛋白含量、°Brix、渗透压或紫外–可见吸光度（200–400 nm）方面无实质性差异。对照包括以与提取物相同方式处理的未接种MRS对照、NaOH溶媒对照和渗透压调整的RPMI-1640对照，这些对照仅针对处理基质的某些方面，未能在每个提取物浓度下建立体积、营养成分、蛋白含量或所有其他基质成分的完全匹配，因此不能排除潜在培养基和基质相关混杂效应。AGS细胞经短串联重复（STR）谱分析鉴定（100%匹配），支原体检测包括PCR法MycoSEQ?检测（阴性）和Hoechst 33258染色（阴性），实验使用P8–P15代次。七个提取物浓度（7.81、15.6、31.25、62.5、125、250和500 μL/mL）分别处理24、48和72 h，每种条件包括三个生物学重复（独立培养瓶）和每个生物学重复两个技术重复，最终提取物体积分数为0.78%–50%（v/v）；≥250 μL/mL浓度仅代表探索性体外条件，并非生理或治疗可达到。MTT还原用作细胞代谢活性指标，各孵育期后AGS细胞以终浓度0.5 mg/mL MTT溶液于37 °C孵育4 h，加入100 μL二甲基亚砜（DMSO）溶解甲臜结晶，于570 nm酶标仪测定吸光度，所有数值以未处理对照归一化并表示为相对代谢活性；由于MTT检测反映线粒体还原能力，所有解释严格限于代谢抑制，不作凋亡、坏死或其他细胞死亡形式的声明。相差图像使用Olympus CKX53显微镜以20 × 放大获取，每孔三个生物学重复拍摄五个非重叠视野，图像编码后由三名盲法观察者使用预定义评分系统评估：0 – 正常形态、完整单层；1 – 轻度皱缩、黏附降低；2 – 变圆、部分脱落；3 – 广泛变圆、起泡；4 – 严重脱落、细胞碎片。24、48和72 h剂量–反应关系使用GraphPad Prism（版本9.0）四参数逻辑（4PL）非线性回归分析，归一化MTT吸光度为响应变量、提取物浓度（μL/mL）为预测变量，模型参数包括上下渐近线、Hill斜率和拟合反应曲线中点对应浓度；模型充分性通过拟合曲线、参数估计及其置信区间、残差分布和对替代模型约束的敏感性评估，决定系数（R2）作为拟合优度的描述性指标而非模型有效性或生物学意义的充分证据。估计IC₅₀值为24 h 44.7 μL/mL（95% CI：38.9–51.8）、48 h 21.9 μL/mL（95% CI：18.2–25.7）和72 h 7.8 μL/mL（95% CI：6.5–9.1），代表拟合模型定义的50%反应水平相关浓度；72 h估计值接近最低测试浓度（7.81 μL/mL），其精确性和稳定性需特别谨慎。尽管估计IC₅₀随暴露时间延长而降低，但该模式不应解释为效力增加或代谢物累积活性的证据，此类差异可能反映暴露时间效应、细胞代谢活性或增殖变化或检测相关因素；各孵育期比较需对拟合剂量–反应参数进行适当统计分析，结果因此解释为MTT代谢活性变化的初步、时间特异性估计，而非细胞毒性或抗癌活性的确切衡量。统计分析方面，若浓度和孵育时间采用析因设计联合分析，应报告浓度、时间和浓度×时间交互作用的双因素方差分析（ANOVA）结果，包括F统计量、分子和分母自由度及P值；事后比较应命名所用程序并报告调整后P值和确切比较；若仅在每一时间点分别进行单因素ANOVA，应一致声明且不暗示检验了交互作用。IC₅₀值使用4PL非线性回归分别对每个孵育期估计，这些估计与ANOVA结果分开分析，因为ANOVA不直接估计剂量–反应曲线参数；所有统计分析均在探索性研究设计和MTT检测局限性的背景下解释。

**研究结果** 形态学评估：相差显微镜显示AGS细胞暴露于无细胞L. gasseri提取物后出现浓度相关形态学改变，包括细胞形状和黏附变化，更高浓度和更长暴露期改变更明显；这些观察为描述性，无正交验证不能确立细胞死亡、细胞毒性或细胞数量减少，形态学发现应与MTT检测局限性一并解释（图1）。24 h处理后的细胞代谢活性：暴露24 h后，相对MTT代谢活性在所测浓度范围内下降，从7.81 μL/mL的87%降至31.25 μL/mL的60%和500 μL/mL的16%；这些数值描述所测体外条件下MTT信号变化，不应解释为细胞死亡或癌症特异性效应的直接证据（图2）。48 h处理后的细胞代谢活性：暴露48 h后，相对MTT代谢活性在所测浓度范围内更低，250–500 μL/mL时报告信号接近约5%；由于高提取物体积分数可能改变培养基组成且潜在MTT干扰未解决，这些结果应谨慎解释，不应视为细胞丢失或细胞毒性的确切证据（图3）。72 h处理后的细胞代谢活性：72 h后观察到相对代谢活性进一步下降，提取物在所有测试浓度产生50–96%的代谢活性降低，500 μL/mL时不足5%的细胞保留可测活性；即使最低浓度（7.81 μL/mL）也将代谢活性降至约50%，确认强时间依赖性抑制作用（图4）。24、48和72 h比较代谢活性：比较62.5、125、250和500 μL/mL在三个孵育期的相对MTT代谢活性显示，更高浓度和更长暴露时间下测得信号更低；该模式应描述为与浓度和暴露时间的关联，而非累积活性或特定代谢物持续作用的证据（图5）。最有效浓度的代谢活性降低：四个最高测试浓度（62.5–500 μL/mL）在所有评估时间点均与MTT代谢活性降低相关；由于高浓度时提取物占处理体积的很大比例，这些结果也可能反映培养基组成变化或其他基质效应，无适当匹配对照不应描述为效力或提取物特异性生物学活性的证据（图6）。定量代谢活性总结：数据显示强而一致的剂量和时间依赖性代谢活性降低，≥31.25 μL/mL时急剧下降，250和500 μL/mL在所有时间点均低于10%，最大抑制出现在500 μL/mL处理72 h后，代谢活性降至<5%；这些观察描述相对MTT代谢活性，不独立确立细胞死亡、细胞毒性或治疗相关性（表1）。IC₅₀分析：剂量–反应关系使用GraphPad Prism（版本9.0）4PL非线性回归估计24、48和72 h IC₅₀值，相对MTT代谢活性为响应变量，模型拟合用R2评估；估计IC₅₀值为24 h 44.7 μL/mL（R2 = 0.962）、48 h 21.9 μL/mL（R2 = 0.981）和72 h 7.8 μL/mL（R2 = 0.988）（表2），代表各孵育期拟合模型下MTT信号50%变化相关浓度；72 h估计IC₅₀接近最低测试浓度（7.81 μL/mL），令人关注所测浓度范围是否充分表征曲线拐点附近剂量–反应，该估计应谨慎解释。尽管估计IC₅₀随暴露时间延长而降低，但该模式不应解释为抑制效力增加的证据；未对IC₅₀估计进行跨孵育期正式统计比较，观察到的差异显著性未确定；MTT代谢活性变化可能反映暴露时间效应、细胞代谢或增殖改变或检测相关因素，且不能归因于特定细菌代谢物的积累或持续活性，因为提取物未经化学表征且代谢物浓度未测定。尽管R2值表明拟合模型相当好地描述观察数据，但R2本身不能确立模型有效性、参数精确性或生物学意义；进一步评估应包括IC₅₀估计的置信区间、残差分析、替代模型约束的敏感性分析和跨孵育期正式统计比较，低于7.81 μL/mL浓度的额外测试也有助于确定72 h剂量–反应曲线是否充分表征；在这些评估完成前，报告IC₅₀值应视为所研究条件下MTT代谢活性变化的暂定、时间特异性估计。

**讨论与结论** 本研究观察到AGS人胃腺癌细胞暴露于无细胞L. gasseri提取物后MTT代谢活性呈浓度和暴露时间相关性降低。这些发现描述实验条件下测得的MTT反应；由于MTT信号可受细胞数量、细胞代谢状态及测试制剂与检测化学相互作用影响，结果不独立确立细胞毒性、细胞死亡或癌细胞增殖抑制。未充分记录仅含提取物的空白孔，不能排除潜在光学或化学干扰。4PL建模得出估计IC₅₀值24 h 44.7 μL/mL、48 h 21.9 μL/mL和72 h 7.8 μL/mL，代表拟合模型下MTT信号50%变化相关浓度，不应解释为细胞毒性或治疗效力衡量；较晚时间点较低估计与测得反应的时间相关偏移一致，但不确立累积活性、提取物成分持续作用或特定生物学机制；R2（0.962–0.988）描述模型对数据的拟合，但本身不足以确立模型有效性或IC₅₀估计精确性；72 h估计接近最低测试浓度，应谨慎解释。相差显微镜显示AGS细胞暴露于无细胞L. gasseri提取物后形态学改变，但这些观察为描述性，不能独立确立细胞死亡或细胞毒性；同样，MTT信号降低表明所测条件下代谢活性下降，但不一定反映细胞数量相应减少或确认细胞死亡。因此，观察到的形态学和代谢变化应谨慎解释，需采用补充检测评估细胞数量、膜完整性和细胞死亡以确定其生物学意义。既往研究描述了L. gasseri的多种生物学特性，包括有机酸产生及对宿主炎症和免疫通路的潜在影响；涉及其他益生菌菌株和制剂的研究也探讨了凋亡和细胞生长调节相关结局；尽管这些研究提供相关背景，但不确立本研究中观察到的反应机制。提取物化学成分未表征，细胞外pH、氧化应激、炎症介质、免疫反应、凋亡和细胞周期分布均未评估，因此不能将任何特定代谢物或生物学通路归因于观察到的MTT代谢活性降低；此外，使用其他细菌菌株或实验模型获得的结果不能直接外推至本研究制剂或解释为保护或抗癌效应的证据。无细胞L. gasseri提取物暴露后MTT代谢活性变化的潜在机制仍未确定；细菌代谢物可能是潜在贡献者，但其身份、个体活性和相对贡献未确立；孵育期间代谢物组成或丰度变化、潜在益生菌相关效应及胃微环境内相互作用未研究，这些可能性应视为未来研究假设而非本研究支持的 explanation。需要结合化学表征、时间分辨代谢物谱分析、补充生物学检测以及胃癌与非恶性胃上皮细胞比较的进一步研究，以探讨潜在机制并确定观察效应的可重复性和选择性。测试浓度范围7.81–500 μL/mL对应处理体积约0.78%–50%（v/v）；250–500 μL/mL时提取物占培养基很大比例，可能改变营养可用性、血清浓度、离子组成或其他基质特性，这些浓度应视为探索性体外暴露，其生理可达到性和体内相关性未确立；由于未记录完全体积和基质匹配对照，不能排除培养基变化对测得反应的贡献。尽管结果有前景，益生菌治疗应用仍受缺乏疗效、安全性和临床使用标准化指南的限制；尽管若干菌株显示有益效应包括减少化疗相关副作用，临床证据仍不足，免疫受损患者尤其中性粒细胞减少者需谨慎。鉴于肿瘤生物学复杂性和患者变异性，需要大规模临床试验确定最佳菌株、给药策略和治疗方案。研究局限性包括：第一，研究完全在体外条件下进行，不能重现体内胃肿瘤微环境复杂性，包括基质相互作用、免疫反应、营养梯度和动态代谢物周转，观察变化的生物学和转化相关性仍不确定，需在更具生理代表性的系统及适当动物模型中评估。第二，研究限于单一胃癌细胞系（AGS），尽管广泛用于胃癌研究，但不能捕捉胃肿瘤分子和表型异质性，观察到的MTT代谢活性变化不能推广至其他胃癌模型或解释为癌症特异性效应证据；缺乏非恶性胃上皮细胞对照妨碍癌症选择性评估并阻止关于提取物对正常胃上皮细胞安全性的结论；未来研究应包括代表多样分子背景的额外胃癌细胞系及适当非恶性胃上皮对照，以确定观察效应的可重复性并评估潜在选择性。第三，无细胞L. gasseri制剂为粗制未分级，其成分未充分表征以鉴定与观察反应相关的组分；尽管细菌无细胞制剂可能含有机酸、肽、胞外多糖和其他分泌化合物，但特定成分的存在和贡献未在本研究中确立；需进一步生化或代谢组学表征及适当分级和测试以鉴定候选成分并评估其个体效应。第四，研究依赖MTT检测作为主要终点；由于该检测测量代谢活性，MTT信号降低本身不确立细胞死亡或识别其潜在机制；未进行补充机制检测评估凋亡、细胞周期分布、活性氧、caspase激活或膜损伤，因此观察到的MTT信号降低不能归因于凋亡、坏死、自噬或其他特定生物学过程。潜在检测相关和基质相关效应也需考虑：仅含提取物空白孔未记录，MTT读数潜在光学或化学干扰未解决；最高测试浓度含高达50%（v/v）提取物，可能独立于任何特定生物活性效应改变营养可用性、血清浓度、离子组成或其他培养基特性；尽管pH和渗透压已表征，但这些测量不能确立处理与对照条件在所有提取物浓度下完全体积和基质匹配；可用记录也不足以确认单独未处理培养基对照和适当阳性对照；因此，不能排除培养基组成差异和其他基质效应对观察反应的贡献；未来研究应纳入仅含提取物检测空白、跨浓度范围体积和基质匹配对照及适当未处理培养基和阳性对照，以更好区分提取物相关效应与培养环境变化；最高测试浓度应视为实验性体外暴露，其生理可达到性和体内相关性未确立。最后，估计IC₅₀值应解释为暂定、检测特异性估计；完整报告不确定性、剂量–反应模型诊断和基础统计分析对评估其可靠性必要；进一步研究应包括独立生物学重复、补充活力和细胞死亡检测、额外恶性和非恶性胃细胞模型及更全面的提取物表征。总之，这些局限性表明发现应视为MTT代谢活性的探索性变化，而非细胞毒性、抗癌活性、癌症选择性、安全性或治疗潜力的证据；需要额外受控和机制信息丰富的研究确定观察反应的性质、可重复性和潜在生物学意义。结论：在本探索性体外研究中，暴露于无细胞L. gasseri提取物与AGS人胃腺癌细胞MTT代谢活性呈浓度和暴露时间依赖性降低相关。4PL建模得出MTT信号50%变化相关估计浓度24 h 44.7 μL/mL、48 h 21.9 μL/mL和72 h 7.8 μL/mL；这些估计为检测特异性，不应解释为细胞毒性或抗癌效力的直接衡量。研究仅涉及单一癌细胞系和单一代谢检测、缺乏非恶性对照且未包括记录仅含提取物空白以评估MTT检测潜在干扰，因此发现需谨慎解释；此外，高提取物浓度时基质相关效应仍不确定。因此，观察到的MTT信号降低不能确切归因于细胞死亡或任何特定生物学机制。未来研究应纳入仅含提取物干扰对照、体积和基质匹配对照、独立生物学重复、补充检测、提取物化学表征和适当剂量–反应模型诊断；使用额外胃癌模型和非恶性胃上皮细胞评估对确定观察效应的可重复性和选择性也必要。总体而言，这些初步发现描述所测体外条件下MTT代谢活性变化，但不确立细胞毒性、癌症选择性、安全性或临床相关性。