金黄色葡萄球菌乙二醛酶III HchA：抵御亲电物质与氧化应激并促进毒力的分子机制

《Microbiology Spectrum》：Glyoxalase III HchA confers protection against electrophiles and oxidative stress and contributes to the virulence in Staphylococcus aureus

　　

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种主要的人类病原体，在巨噬细胞感染过程中必须应对活性亲电物质（reactive electrophilic species, RES），例如有毒的α,β-二羰基化合物甲基乙二醛（methylglyoxal, MG）。DJ-1/ThiJ/PfpI家族酶HchA此前已在体外被结构和功能鉴定为乙二醛酶III（glyoxalase III）及分子伴侣。在本研究中，研究人员利用转录研究、表型分析和生化实验，探究了S. aureus中HchA在不同氧化还原应激条件及巨噬细胞感染下的表达、氧化还原调控及功能。结果表明，双酰胺（diamide）、甲醛（formaldehyde, FA）、甲基乙二醛（MG）和大蒜素（allicin）应激可强烈上调hchA的转录，而次氯酸（hypochlorous acid, HOCl）和H2O2的诱导作用相对较弱。表型分析显示，ΔhchA突变体对MG、FA、甲基氢醌（methylhydroquinone, MHQ）和HOCl应激的敏感性增加，表明HchA参与抵御亲电物质和氧化剂的防御，且该功能在体内依赖于活性位点Cys190。此外，ΔhchA突变体在小鼠J774A.1巨噬细胞感染期间的存活能力受损。活性测定表明，HchA可将MG直接转化为乳酸，证实其作为乙二醛酶III的功能，且其动力学参数与大肠杆菌（Escherichia coli）的HchA相似。通过质谱分析和PEG-马来酰亚胺烷基化实验，研究人员进一步证明Cys190在体内和体外均对H2O2诱导的过度氧化高度敏感。然而，柠檬酸合酶聚集实验未显示还原态或氧化态HchA具有特异性伴侣活性。综上所述，研究数据揭示HchA作为一种氧化还原敏感的乙二醛酶III，在S. aureus中提供对亲电物质的抗性，并促进其在巨噬细胞感染期间的存活。

金黄色葡萄球菌HchA：抵御亲电物质与氧化应激的氧化还原敏感型乙二醛酶III及其毒力贡献

一、研究背景与科学问题

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种机会性人类病原体，可定植于人体皮肤和呼吸道，同时也能引发严重的医院获得性感染，如败血症、肺炎和骨髓炎。作为ESKAPE病原体之一，多重耐药S. aureus菌株因治疗选择有限，在全球范围内造成沉重的健康负担和高死亡率。在感染过程中，S. aureus必须应对宿主先天免疫防御中活化巨噬细胞和中性粒细胞产生的多种活性物质，包括活性氧（reactive oxygen species, ROS）、次氯酸（HOCl）和活性亲电物质（RES）。

近年研究发现，活化巨噬细胞在有氧糖酵解过程中会产生高水平的甲基乙二醛（MG）作为抗菌效应分子。MG是一种强亲电性的α,β-二羰基化合物，可通过Maillard反应与半胱氨酸残基的巯基、赖氨酸和精氨酸的氨基、脂质及DNA碱基反应，形成晚期糖基化终产物，对细菌具有高度毒性。在大肠杆菌（E. coli）中，MG的解毒主要由谷胱甘肽（GSH）依赖的乙二醛酶系统催化，包括乙二醛酶I（GloA）和乙二醛酶II（GloB）。此外，E. coli还编码多种DJ-1/ThiJ/PfpI家族的乙二醛酶III同源物（如HchA、YajL、YhbO和ElbB），它们能以不依赖GSH的方式将MG直接转化为乳酸。

然而，对于不产生GSH、而利用杆菌硫醇（bacillithiol, BSH）作为替代低分子量硫醇的厚壁菌门（Firmicutes），如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和S. aureus，其乙二醛酶系统的研究十分有限。在S. aureus中，DJ-1/ThiJ/PfpI家族蛋白HchA虽已在体外被证实具有乙二醛酶III和伴侣holdase功能，但其在体内抵御MG等亲电物质的作用尚未被探索。因此，本研究旨在系统阐明S. aureus中HchA在MG解毒中的转录调控、氧化还原敏感性及生物学功能。

二、主要技术方法

本研究采用以下关键技术方法：定量实时PCR（qRT-PCR）和Northern blot分析hchA的转录调控；5′端深度RNA测序（5′ deep RNA-seq）进行启动子作图；通过pMAD穿梭载体进行等位基因替换构建ΔhchA突变体，利用pRB473质粒构建S. aureus COL hchA⁺、hchA-C190S和hchA-C214S互补菌株；小鼠J774A.1巨噬细胞感染实验评估胞内存活；基于1,2-二氨基苯（DB）衍生化和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量胞内MG水平；PEG-马来酰亚胺（PEG-mal）烷基化实验和LC-MS/MS分析鉴定HchA半胱氨酸的翻译后硫醇修饰；乙二醛酶III活性测定（MG消耗和D-乳酸生成）；柠檬酸合酶聚集实验评估伴侣活性。

三、研究结果

1. hchA的转录受亲电物质和氧化剂上调

qRT-PCR和Northern blot分析表明，hchA的转录在双酰胺（diamide）和甲醛（FA）应激下分别被强烈上调44倍和29倍，而MG、大蒜素（allicin）、HOCl和H₂O₂应激导致2至6倍的上调。值得注意的是，醌类物质MHQ和MBQ反而显著下调hchA转录，可能与其不可逆烷基化蛋白巯基的毒性效应有关。5′ RNA-seq分析将hchA的转录起始位点（TSS）定位在一个推测的SigmaA依赖性启动子下游。

2. HchA赋予对亲电物质和氧化剂的抗性，且依赖于活性位点Cys190

在生长实验中，ΔhchA突变体在醌类和HOCl应激下较野生型显著生长延迟。在存活实验中，ΔhchA突变体在致死剂量的FA、MG和MHQ应激下存活率显著低于野生型和hchA⁺互补菌株。C190S突变体的存活缺陷与ΔhchA突变体相似，而C214S突变体的存活率与hchA⁺互补菌株相当，证实Cys190对HchA的保护功能至关重要。

3. HchA促进S. aureus在小鼠巨噬细胞内的存活**

在J774A.1巨噬细胞感染实验中，感染后24小时，ΔhchA突变体和C190S突变体的存活率分别为13.7%±2.7%和13.3%±3.4%，显著低于野生型的20.4%±0.9%。hchA⁺互补菌株的存活率恢复至野生型水平，表明HchA通过其活性位点Cys190促进S. aureus在巨噬细胞内的存活。

4. 硫醇反应性氧化剂不增加S. aureus胞内MG水平**

LC-MS/MS定量分析显示，S. aureus COL野生型在10⁹个细胞中基础MG水平约为0.05 nmol，暴露于双酰胺、FA、H₂O₂和HOCl应激后并未显著升高。外源添加0.5 mM MG后，野生型、ΔhchA突变体和hchA⁺互补菌株的MG水平分别为约1、1.3和1.4 nmol，ΔhchA突变体与互补菌株之间无显著差异，提示其他酶或低分子量硫醇可能在体内补偿HchA的缺失。

5. HchA活性位点Cys190在氧化应激下对过度氧化高度敏感

PEG-mal烷基化实验表明，H₂O₂处理导致HchA WT和C214S突变体的一个Cys被完全氧化，而C190S突变体不受影响，表明Cys190是氧化还原敏感的活性位点。LC-MS/MS分析进一步证实，H₂O₂和BSH处理导致Cys190完全过度氧化为亚磺酸（Cys-SO₂H）和磺酸（Cys-SO₃H），而Cys214基本保持还原状态。体内实验同样显示，20 mM H₂O₂应激使Cys190的过度氧化肽段谱图计数增加4至5倍，而MG应激未引起显著变化。

6. HchA作为氧化还原敏感的乙二醛酶III，其活性因Cys190过度氧化而受到抑制

MG消耗实验和D-乳酸生成实验证实，还原态HchA WT和C214S突变体具有乙二醛酶III活性，而C190S突变体无活性。H₂O₂氧化处理使HchA WT和C214S突变体的MG消耗能力丧失，表明Cys190的过度氧化导致酶活性不可逆失活。动力学分析显示，HchA的K_M为1.174 mM，k_cat为134.9 min^?1，与E. coli HchA的动力学参数相近。

7. HchA在体外不表现特异性伴侣活性

在柠檬酸合酶聚集实验中，还原态或氧化态HchA（10倍、20倍和40倍摩尔过量）均未表现出浓度依赖性的抗聚集活性，而氧化态Get3作为阳性对照能有效抑制柠檬酸合酶聚集超过50%。因此，与先前研究不同，本研究未能证实S. aureus HchA具有特异性伴侣holdase活性。

四、讨论与结论

本研究表明，S. aureus HchA是一种重要的不依赖硫醇的乙二醛酶III，其转录受亲电物质和硫醇特异性氧化剂上调。HchA赋予S. aureus对醛类、醌类和HOCl的抗性，并通过活性位点Cys190促进其在巨噬细胞感染中的存活，提示乙二醛酶III功能 contributes 至S. aureus的毒力。研究还发现，Cys190对H₂O₂诱导的过度氧化高度敏感，导致其乙二醛酶功能不可逆失活，而Cys214对氧化不敏感且不参与催化。与E. coli HchA不同，本研究未能证实S. aureus HchA具有特异性伴侣活性。研究人员推测，HchA可能作为一种混杂解毒酶参与多种亲电物质的清除，其转录调控可能受某种尚未鉴定的硫醇依赖性转录因子控制。此外，S. aureus编码的另一个DJ-1/ThiJ/PfpI同源蛋白SACOL1933可能部分补偿HchA缺失的功能。未来研究应聚焦于阐明hchA转录的调控机制，以及HchA在抵御亲电物质和氧化剂防御中的具体作用机制。