高分辨率食管测压联合组织蛋白质组学鉴定与嗜酸性粒细胞性食管炎患者质子泵抑制剂治疗反应相关的候选生物标志物

《Sci》：High-Resolution Esophageal Manometry and Tissue Proteomics Identify Candidate Biomarkers Associated with Proton Pump Inhibitor Responsiveness in Eosinophilic Esophagitis

　　

背景：嗜酸性粒细胞性食管炎（EoE）是一种以食管功能障碍和嗜酸性炎症为特征的慢性免疫介导性疾病。通过高分辨率食管测压（HRM）测定的食管内团注压力（IBP）已成为一种潜在的标志物，可用于区分对质子泵抑制剂（PPI）治疗有反应的患者与存在早期纤维化改变且治疗反应不佳的患者。本研究旨在鉴定可预测PPI治疗反应的组织生物标志物。方法：24例EoE患者接受了上消化道内镜检查，并自食管中段取活检组织用于蛋白质组学和Galectin-3（Gal-3）免疫组化分析。其中20例患者还接受了HRM以评估IBP。研究人员比较了PPI治疗有反应与无反应患者之间的蛋白质组学图谱。结果：IBP在健康对照、PPI治疗有反应和无反应患者之间存在显著差异。蛋白质组学分析鉴定出1445种蛋白质，其中包括456种共有蛋白质以及各反应组之间的58种差异表达蛋白质。免疫组化显示，PPI治疗有反应患者的Gal-3表达显著高于无反应患者，并经定量图像分析证实（阳性细胞百分比，p < 0.01；阳性面积百分比，p < 0.005）。结论：将HRM与蛋白质组学及免疫组化分析相结合，鉴定出了与EoE中PPI治疗反应相关的功能和分子差异。Galectin-3和IBP成为与治疗反应相关的候选生物标志物。在确立其用于患者分层的潜在临床价值之前，这些发现需要在更大规模的独立队列中加以验证。

嗜酸性粒细胞性食管炎（EoE）是一种以食管功能障碍症状和食管黏膜组织学检查示显著嗜酸性粒细胞浸润为特征的慢性免疫介导性炎症性疾病，其诊断标准为至少一处食管活检组织中每高倍视野（HPF）≥15个嗜酸性粒细胞，全球发病率和患病率呈持续上升趋势。尽管其确切病因尚不明确，但大量证据支持过敏致敏在其发病中起关键作用，该病以辅助性T细胞2型（Th2）驱动的免疫反应为特征，导致食管上皮嗜酸性粒细胞浸润并伴活化T淋巴细胞和肥大细胞浸润，这些免疫细胞促进包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和嗜酸性粒细胞趋化因子-3（eotaxin-3）在内的促炎介质产生，而eotaxin-3、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）及2型细胞因子（特别是IL-4和IL-13）参与炎症持续和成纤维细胞活化，最终导致组织重塑、纤维化、食管功能障碍和食团嵌顿。未确诊的EoE目前估计占PPI难治性反流症状患者的10%。因此，上消化道内镜联合多点食管活检仍是诊断基石。除内镜外，越来越多的注意力转向EoE患者食管运动功能的评估，尽管尚未发现特征性动力异常，但近期证据提示通过HRM测定的IBP可能区分以炎症为主的表型与纤维狭窄表型。与其他2型炎症性疾病类似，EoE在临床表现、疾病进展和治疗反应方面存在显著异质性，越来越多的临床和分子证据支持存在不同的EoE内型和表型，凸显了个体化治疗策略的必要性。在此背景下，研究人员开展了本研究，旨在通过整合高分辨率食管测压、鸟枪法蛋白质组学、蛋白质网络分析和免疫组化验证，鉴定与EoE中PPI治疗反应相关的蛋白质组学特征，假设不同的分子表型是PPI治疗异质性反应的基础，并可鉴定用于治疗前患者分层的候选生物标志物。

研究人员开展的研究如下：回顾性纳入24例确诊EoE的成年患者（17–68岁），纳入标准为记录有EoE诊断、临床评估前4周内每周至少2次固体食物吞咽困难发作且未启动排除饮食；排除标准涵盖其他原因所致食管嗜酸性粒细胞增多及多种伴随疾病和状态。10名无食管疾病史的健康志愿者（2名女性、8名男性，中位年龄52.2岁）接受HRM作为对照组。所有患者接受上消化道内镜，按方案于食管近段、中段和远段各取4块活检组织，由经验丰富的胃肠道病理学家独立进行组织病理学评估。在高剂量PPI治疗8周后（早餐前半小时和晚餐前半小时各口服40 mg泮托拉唑一片），重复内镜和活检，根据组织学反应（嗜酸性粒细胞密度小于或大于每高倍视野15个）将患者分为PPI反应性食管嗜酸性粒细胞增多症（PPI-REE；n = 12）和非PPI反应性食管嗜酸性粒细胞增多症（NON PPI-REE；n = 12）。仅基线内镜中取自食管中段的活检标本用于蛋白质组学分析。所有参与者在诊断测试前签署书面知情同意书。研究遵循赫尔辛基宣言伦理原则，依据意大利药品管理局（2008年3月20日）关于使用匿名数据的回顾性观察性研究的规定，该规定不强制要求伦理委员会批准或知情同意；由于其为回顾性观察性设计，仅依赖常规医疗中收集的去标识化和完全匿名化临床数据，故根据机构对历史去标识化数据的实践，免于机构审查委员会/伦理委员会正式批准。患者数据严格按照欧盟通用数据保护条例（GDPR）处理。

研究结果如下：3.1 食管内团注压力 对20例EoE患者（3名女性、17名男性；中位年龄35.5岁）和10名健康对照（2名女性、8名男性；中位年龄52.2岁）进行了HRM，其中10例分类为PPI-REE，10例分类为NON PPI-REE，无患者显示食管狭窄的内镜证据。基线时食管中段活检标本的中位嗜酸性粒细胞计数在PPI-REE组为29个/HPF（95% CI，20.0–65.2），在NON PPI-REE组为49个/HPF（95% CI，29.2–64.4），组间无统计学显著差异（p = 0.12）。中位远端收缩积分（DCI）在PPI-REE组为1578.0 mmHg·s·cm（95% CI，322.1–2608.8），在NON PPI-REE组为821.5 mmHg·s·cm（95% CI，290.4–2487.0），组间无显著差异（p = 0.393）；中位整合松弛压（IRP）在PPI-REE组为14.5 mmHg（95% CI，10.0–24.4），在NON PPI-REE组为14.0 mmHg（95% CI，5.8–17.2），差异亦无统计学意义（p = 0.579）。相比之下，IBP在健康对照、PPI-REE患者和NON PPI-REE患者之间存在显著差异，中位IBP值分别为健康对照12.2 mmHg、PPI-REE组16.0 mmHg（95% CI，14.5–17.4）、NON PPI-REE组18.5 mmHg（95% CI，15.7–18.8）；与健康对照相比，PPI-REE和NON PPI-REE患者的IBP均显著升高（两者p < 0.0001），且NON PPI-REE患者的IBP显著高于PPI-REE患者（p = 0.0115）；DCI仅在健康对照与NON PPI-REE患者之间存在显著差异（p = 0.0185），DCI和IRP的其余比较均无统计学意义。3.2 蛋白质组学分析 基于单维微液相色谱-串联质谱（μLC–MS/MS）的鸟枪法非标记蛋白质组学分析在24份来自PPI-REE和NON PPI-REE患者治疗前食管活检标本的数据集中鉴定出3224条独特肽段，对应1445种不同蛋白质。完整蛋白质组数据集存放于MassIVE数据库（登录号MSV000091678）。技术重复和生物学重复均显示强线性相关，R²值≥0.855，平均回归斜率1.028 ± 0.10，接近理论值1.0。将1445种鉴定蛋白按理论分子量和等电点映射到MAProMa算法生成的二维虚拟蛋白质组图谱上，蛋白质广泛分布证实了鸟枪法蛋白质组学鉴定宽范围分子量和等电点蛋白质的能力。比较两组蛋白质组图谱显示，456种蛋白质为PPI-REE和NON PPI-REE组共有，600种蛋白质仅在PPI-REE组检出，389种仅在NON PPI-REE组鉴定。3.3 差异蛋白质组学分析 鉴于蛋白质组学分析的探索性，对个体食管活检标本的蛋白质组数据集进行归一化并接受多种统计学检验。经线性判别分析（LDA）选出30种在PPI-REE和NON PPI-REE患者间具有区分能力的蛋白质，但Benjamini–Hochberg校正未提供显著结果；尽管如此，基于LDA筛选蛋白的无监督层次聚类显示样本清晰分离，与临床分类基本一致，24例患者中22例按PPI治疗反应正确分类；两例临床分类为NON PPI-REE的患者（A2和A4）聚类于PPI-REE分支内，但这些样本形成独立亚簇，提示其蛋白质组图谱与PPI反应患者并不完全重叠。采用MAProMa平台的差异平均值（DAve）和差异置信指数（DCI）算法进一步评估差异蛋白丰度，共鉴定出32种差异表达蛋白质（DEPs），其中14种在PPI-REE组中丰度较低、18种丰度较高；此外，基于Student's t检验（p < 0.05）有37种蛋白质呈现差异丰度。综合所有统计学检验，共筛选出58种候选DEPs；值得注意的是，HSPA1B、PKM、GAPDH和KRT75四种蛋白质通过所有检验，58种中有37种在三种检验中至少两种显著。参与中间丝组织的蛋白质（包括多种角蛋白）在NON PPI-REE患者中主要丰度更高；相反，与染色质组织、核糖体功能及RNA加工和剪接相关的蛋白质在PPI-REE患者中丰度更高。Galectin-3（LGALS3）及参与糖酵解代谢的蛋白质（包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和丙酮酸激酶M（PKM））在PPI-REE组中表达亦更高。3.4 蛋白质-蛋白质相互作用与功能富集分析 将候选区分蛋白按功能注释分类并整合入智人蛋白质-蛋白质相互作用网络，所得网络包含61种蛋白质、131个蛋白质-蛋白质相互作用。网络揭示了若干功能互连的蛋白质群，包括与细胞骨架组织（如中间丝和肌动蛋白骨架）、核糖体功能、能量代谢、细胞外基质组织、遗传信息处理、免疫反应和蛋白质折叠相关的蛋白质。网络包含多种中间丝蛋白，如角蛋白（KRT2、KRT3、KRT4、KRT5、KRT6A、KRT6B、KRT14、KRT15、KRT16、KRT17、KRT73和KRT75）和波形蛋白（VIM），以及细胞骨架蛋白（ACTA2）和细胞外基质相关蛋白（COL6A1、COL6A3、POSTN和LGALS3）；大多数蛋白质特别是角蛋白在NON PPI-REE患者中丰度更高，而细胞外基质蛋白下调。网络还包含若干核糖体和RNA加工蛋白，呈上调和下调混合状态，具体而言RPL23A、RPL4、RPL7L1、RPLP1、RPS10-NUDT3、HNRNPC、NPM1和LUC7L2在PPI-REE中上调，而RPL12、RPL29、RPS3A和SF3B3下调。代谢相关蛋白包括TPI1、GPI、GAPDH和PKM在PPI-REE患者中丰度更高。参与蛋白质折叠和细胞应激反应的蛋白质包括PPIA、HSP90B1、HSPB1和HSPA1B在PPI-REE中上调。差异表达蛋白质被归入六大功能类别：细胞骨架、能量代谢、细胞外基质、遗传信息处理、免疫系统和蛋白质折叠。参与细胞骨架组织的蛋白质在PPI-REE患者中主要丰度较低、在NON PPI-REE患者中丰度较高；相反，与细胞外基质组织和遗传信息处理相关的蛋白质在PPI-REE组中主要丰度更高、在NON PPI-REE组中较低；参与能量代谢、免疫反应和蛋白质折叠的蛋白质在PPI-REE患者中总体丰度也更高。3.5 Galectin-3免疫组化分析 免疫组化染色揭示两种EoE表型中Galectin-3（Gal-3）表达模式不同，Gal-3免疫反应性主要定位于食管鳞状上皮细胞胞质内。定量图像分析显示PPI-REE患者活检标本中Gal-3表达显著高于NON PPI-REE患者，两项定量参数均证实此差异：PPI-REE组Gal-3阳性细胞百分比显著更高（p < 0.005），Gal-3阳性组织面积百分比亦显著更高（p < 0.01）。

讨论部分总结：本研究结合高分辨率食管测压、非靶向组织蛋白质组学和免疫组化验证，探讨了EoE患者对PPI治疗反应相关的生物学特征，主要有三项发现：第一，尽管无内镜下明显纤维狭窄，PPI治疗无反应患者的基线IBP显著高于有反应者；第二，PPI有反应与无反应患者治疗前食管活检标本显示涉及细胞骨架组织、能量代谢、细胞外基质重塑、遗传信息处理、免疫反应和蛋白质折叠的 distinct 蛋白质组学图谱；第三，Galectin-3在PPI有反应患者基线食管活检中表达显著更高，因而代表治疗反应的候选组织生物标志物。目前EoE的治疗选择包括PPIs、吞服局部糖皮质激素、排除饮食及部分患者的生物制剂治疗，但治疗选择在很大程度上仍依赖经验，因为目前尚无经验证的可预测治疗反应的预处理生物标志物；鉴定与治疗结局相关的功能和分子特征可改善患者分层、减少无效治疗暴露并支持更个体化的疾病管理方法。关于IBP与食管功能障碍，测压发现提示IBP根据后续PPI治疗反应而不同，NON PPI-REE患者基线IBP值显著高于PPI反应患者，尽管均无食管狭窄或明显纤维狭窄性疾病的内镜证据；Colizzo等曾报道IBP升高可区分纤维狭窄型与以炎症为主的EoE表型，与本研究中患者无内镜下可检测纤维狭窄不同，无反应者IBP升高可能反映食管顺应性、壁力学或食团通过阻力的细微变化，这些变化先于固定结构异常出现，但由于未直接测量食管扩张性，此解释应视为假说生成性。既往HRM研究记录了EoE中异质性动力异常，Martin等报道约80%患者存在动力异常，全食管增压是最常见模式；Roman等也发现EoE患者异常增压模式（包括全食管和分隔性远端增压）较健康对照或胃食管反流病患者更频繁；在本队列中，1例PPI反应患者和5例无反应患者检测到异常增压，总体40%患者根据芝加哥分类显示食管动力障碍证据，这些观察强化了EoE中食管功能障碍具有异质性且不能仅用可见管腔狭窄解释的概念。IBP的生物学解释与既往生理学研究一致，Ren等采用同步视频荧光透视和腔内测压记录证明IBP随食团体积、食团黏度和食团流出阻力增加而增加，因此IBP反映吞咽食团内因食管收缩性、管腔几何形态、壁顺应性和远端流出阻力相互作用而产生的压力；尽管基于Laplace的生物力学原理可能有助于解释管腔尺寸、腔内压力和壁张力之间的关系，但无反应患者中观察到的较高IBP不能归因于单一机制，可能反映食管顺应性降低、低度重塑、神经肌肉协调改变或食管胃交界处阻力增加；重要的是DCI和IRP未能显著区分PPI有反应与无反应患者，在样本量限制下，IBP似乎比常规收缩或交界处松弛指标提供更大的区分信息。总之，这些发现支持进一步研究IBP作为与PPI治疗反应相关的功能标志物，但本研究数据未确立明确的诊断阈值，也未证明IBP升高直接预测纤维狭窄进展，需要前瞻性研究将HRM与食管扩张性测量和纵向结构评估相结合以阐明其预后价值。关于与PPI反应相关的独特蛋白质组学图谱，蛋白质组学部分证明共享同一临床诊断的队列内存在显著分子异质性，PPI有反应与无反应患者治疗前食管活检显示不同的蛋白质表达谱，监督层次聚类根据临床反应正确区分了24名参与者中的22名；两例临床无反应但聚类于PPI反应分支的患者形成独立亚簇，可能反映中间生物学特征或临床定义表型内的残余异质性。这些发现支持PPI治疗反应与治疗前已可检测的潜在生物学差异相关的概念；差异丰度蛋白质涉及六大功能类别，提示上皮结构、细胞代谢、应激反应和免疫活动的协调差异，而非孤立的分子改变。NON PPI-REE表型以若干结构蛋白（特别是角蛋白）以及细胞骨架组织和组织重塑相关蛋白丰度更高为特征，上皮结构蛋白表达增加可能反映上皮分化改变、屏障损伤或对慢性机械和炎症应激的适应反应；骨膜蛋白和其他重塑相关蛋白也可能与细胞外基质沉积和早期组织重塑倾向增加一致，但由于分析在整块活检标本上进行且未确定每种蛋白质的细胞来源，这些通路层面的解释需用空间或细胞特异性方法确认。相反，参与免疫调节、抗氧化防御、能量代谢和蛋白质折叠的蛋白质在PPI反应患者中总体丰度更高；参与糖酵解的蛋白质（包括GAPDH和PKM）可能提示两种表型间上皮代谢活动的差异；分子伴侣和参与遗传信息处理的蛋白质变异可能反映细胞活化、应激适应或黏膜修复的不同状态。PPI反应组中若干胶原相关蛋白丰度较高应谨慎解释，尽管胶原通常与细胞外基质重塑相关，但其生物学意义可能因胶原亚型、组织隔室、周转状态及与上皮修复过程的相互作用而异，因此这些发现不应被解释为PPI反应患者存在更晚期纤维化的直接证据。总体而言，蛋白质组学分析表明PPI反应性与复杂的分子表型相关而非单一炎症通路；LDA、基于MAProMa的差异分析、层次聚类和网络重建的整合增强了观察到的组间差异的一致性，但区分性特征仍属探索性，需在独立队列中使用靶向定量方法验证。关于Galectin-3作为治疗反应候选生物标志物，Galectin-3是一种嵌合型β-半乳糖苷结合凝集素，具有背景依赖性的促炎、抗炎和修复功能，可在细胞内表达、展示于细胞表面或由活化、应激或损伤细胞释放至细胞外隔室，支持其作为组织或循环生物标志物的潜在价值。既往研究将Galectin-3与气道炎症和重塑相关联，在重症过敏性哮喘中Galectin-3与治疗反应及奥马珠单抗治疗期间气道重塑调节相关；这些观察与EoE相关，因为两者均为以2型免疫极化、嗜酸性粒细胞募集、肥大细胞活化、上皮功能障碍和组织重塑为特征的慢性抗原驱动性炎症性疾病。Galectin-3在食管鳞状上皮细胞和胃腺上皮中生理性表达，然而其生物学作用具有组织和背景依赖性，哮喘研究结果不能直接外推至食管。实验证据表明其可调节上皮连接复合体（包括桥粒、黏附连接和紧密连接），从而参与屏障组织和修复，其在PPI反应患者中表达较高可能因此识别出一种以修复能力保留、代谢活化改变或炎症损伤可逆性更大为特征的上皮状态。另一方面，Galectin-3增加可能直接参与炎症信号传导，其已被牵涉于2型免疫反应、嗜酸性粒细胞生物学、肥大细胞活化和白细胞募集，因此其表达可能反映免疫-上皮串话的差异而非单纯结构或修复过程；本研究无法区分Galectin-3是机制性促进PPI反应还是作为更广泛反应性内型的标志物。局部物理化学环境可能进一步调节Galectin-3活性，von Mach等证明细胞外pH影响Galectin-3的碳水化合物结合特异性和自缔合，改变含Galectin-3分子网络的形成和组成；由于PPIs改变酸相关条件并可能发挥不依赖抑酸的抗炎作用，Galectin-3的pH依赖性调节是一个有趣的生物学假说，但本研究未测量组织pH或评估治疗后Galectin-3变化，因此不能从这些数据推断PPI诱导的pH改变与Galectin-3活性之间的直接关系。基于这些原因，在蛋白质组学鉴定的蛋白质中，Galectin-3因其在PPI有反应与无反应患者间的差异丰度及其与上皮稳态、炎症和组织重塑的生物学相关性而被选用于免疫组化验证；免疫组化分析旨在提供对这一生物学优先候选物的独立组织水平验证，而非验证完整的蛋白质组学特征。免疫组化分析证实PPI有反应患者基线Galectin-3表达显著高于无反应者，无论以阳性上皮细胞百分比还是阳性染色组织面积百分比衡量均如此；非靶向蛋白质组学发现与组织水平验证之间的一致性增强了Galectin-3作为候选生物标志物的生物学合理性，然而其诊断性能、最佳阈值、敏感性、特异性及相对于临床或测压变量的增量价值仍有待确定。关于临床意义，功能和分子测量的整合是本研究的主要优势，HRM识别了食团相关压力的功能差异，而蛋白质组学揭示了不同的生物学通路，免疫组化验证了特定的组织候选物；这些互补发现提示PPI有反应与无反应患者不仅治疗结局不同，基线食管生物力学和黏膜生物学也可能不同。从临床角度看，结合IBP和Galectin-3等组织生物标志物的联合模型可能潜在地支持治疗前分层，这种方法可能有助于识别对PPI治疗反应概率较高的患者以及可能受益于早期考虑替代治疗的患者；然而本研究并非为开发或验证临床预测模型而设计，IBP和Galectin-3的联合预测性能因此在临床实施前必须进行前瞻性评估。还需认识到PPI反应性食管嗜酸性粒细胞增多症一词已逐渐被纳入EoE谱系而非视为独立疾病实体，在此背景下PPI反应性应被视为EoE内的治疗反应表型；在本研究中保留PPI-REE和NON PPI-REE术语有助于描述预定义比较组，但结论不应暗示这些组代表完全独立的疾病。关于优势与局限性，本研究主要优势包括患者的前瞻性特征描述、治疗前活检标本的使用、功能和分子数据的整合以及蛋白质组学鉴定候选物的免疫组化验证；FFPE组织分析也证明了从常规收集的病理材料中提取临床相关分子信息的可行性。然而应考虑若干局限性：第一，样本量相对较小，尤其是HRM分析，可能限制了识别额外差异或校正潜在混杂因素的统计效能，因此本研究应视为探索性；此外健康对照年龄大于EoE队列，由于健康受试者仅作为HRM的生理参考纳入，EoE患者与对照之间的比较应谨慎解释，因为不能排除年龄的潜在影响。第二，队列来自有限的临床环境，外部有效性仍不确定，蛋白质组学特征和Galectin-3发现需要在更大规模、独立且最好是多中心的队列中重复验证。第三，蛋白质组学分析在整块食管活检标本上进行，观察到的蛋白质谱可能反映上皮、基质、血管和免疫细胞隔室的贡献，空间蛋白质组学、单细胞方法或多重组织成像将有助于确定候选蛋白的细胞来源。第四，本研究评估了基线组织但未包括配对的治疗后蛋白质组学和免疫组化分析，因此尚不清楚Galectin-3表达在PPI治疗后是否变化或表达变化是否与组织学缓解相关。第五，无食管扩张性和纤维化的直接测量，所提出的IBP升高与早期生物力学重塑之间的关系仍属推断性，将HRM与功能腔成像探头测量、详细内镜评分和重塑的定量组织学评估相结合将加强未来研究。第六，尽管Galectin-3作为蛋白质组学分析鉴定的代表性候选物经免疫组化验证，但其他差异表达蛋白质未在组织水平独立验证，因此本研究发现不应被解释为对蛋白质组学特征的全面验证，需要在更大独立队列中验证其他候选蛋白。最后，未进行正式的预测模型或受试者工作特征分析，因此Galectin-3和IBP应被描述为与治疗反应相关的候选生物标志物而非经验证的预测因子。

研究结论部分翻译：总之，本研究在治疗开始前鉴定出PPI有反应与无反应EoE表型之间的功能和分子差异。无反应患者中较高的IBP提示即使无明显的纤维狭窄也存在食管生物力学改变。治疗前蛋白质组学分析揭示了与治疗结局相关的不同生物学特征，而免疫组化分析证实PPI有反应患者中Galectin-3表达较高。这些发现支持进一步评估IBP和Galectin-3作为患者分层的互补候选生物标志物。在更大独立队列中的验证、配对治疗前后标本的分析以及整合预测模型的开发对于确定其临床价值和推进EoE精准医学至关重要。