热带泥炭沼泽森林不同微生境土壤细菌群落与可培养放线菌多样性：16S rRNA基因扩增子测序与培养法的整合解析

《Bacteria》：Bacterial Community and Culturable Actinomycete Diversity in Tropical Peat Swamp Forest Soils

　　

热带泥炭沼泽森林（TPSFs）为常年积水、酸性的生态系统，其微生物群落特征仍研究不足，尤其是包含众多生物活性次级代谢产物高产类群的Actinomycetota门。本研究结合16S rRNA基因扩增子测序与培养依赖的分离方法，表征泰国罗勇府Nong Chamrung泥炭沼泽森林林地表与湿地两类微生境中细菌群落组成及放线菌多样性。研究人员对10份土壤样品进行16S rRNA基因（V3–V4）扩增子测序，以评估分类学组成及α多样性与β多样性。同时，采用选择性培养基分离放线菌，并通过16S rRNA基因测序与系统发育分析进行鉴定。测序共获得155,094条高质量序列读长和236个操作分类单元（OTUs），由五个门主导；与湿地样品相比，Actinomycetota在林地表样品中显著富集（LDA = 5.00，p = 0.017），而α多样性在两类生境间无显著差异，β多样性呈现接近显著的生境趋势。扩增子测序鉴定出Acidothermus与Mycobacterium为优势Actinomycetota属。相比之下，培养依赖的分离获得53株菌株，代表八个属，其中Streptomyces占分离株的47.17%，尽管其在扩增子数据集中相对丰度较低。TPSF生境蕴含独特的放线菌群落，培养依赖的分离揭示了一个重要组分——尤其是Streptomyces——其在扩增子测序中代表性不足。这一差异凸显了培养非依赖与培养依赖方法的互补价值，并支持热带泥炭沼泽森林土壤作为可培养放线菌进一步生物勘探的潜力资源库。

研究背景与问题：热带泥炭沼泽森林（TPSFs）主要分布于东南亚，以积水条件下植物残体累积为特征，是高湿高温、高降雨的低洼生态系统，其大量有机质构成碳储库，影响全球碳循环与温室气体排放。微生物是有机质转化与生物地球化学循环的关键驱动者，但TPSFs微生物群落及其与环境条件的关系仍表征不足。Actinomycetota在陆地与水生生态系统中广泛分布，其中Streptomyces、Micromonospora及稀有放线菌以产生抗菌、抗真菌、抗癌、驱虫等结构多样的次级代谢产物著称，是药物、农业与生物技术领域天然产物的重要来源。然而，对常见陆生放线菌的重复筛选常导致已知化合物被重复发现，降低传统天然产物发现效率；培养非依赖研究亦表明常规培养仅能回收环境样品中微生物多样性的一部分，大量分类学与生物合成多样性尚未被探索。因此，稀有放线菌及来自研究不足或环境选择性强生境的微生物日益受到关注。极端或波动性理化条件（温度、盐度、水分可利用性、压力、pH）可能施加选择压力， favors具有独特生理与代谢适应的微生物。研究人员假设热带泥炭沼泽环境营养贫乏、酸性的条件可能有利于具特殊适应机制的放线菌，这些适应可能与独特生物合成能力相关，是新颖次级代谢产物与生物活性化合物的潜在来源。此前泰国泥炭沼泽森林的培养依赖研究已表明该类生态系统是放线菌多样性的资源库，从这些环境获得的 novel分类单元包括Asanoa siamensis、Streptomyces acidicola、Dactylosporangium sucinum、Streptomyces rugosispiralis、Streptomyces actinomycinicus、Streptomyces humicola及Streptomyces macrolidinus sp. nov.等，其中后者对Enterococcus faecium、Colletotrichum capsici和Colletotrichum gloeosporioides具抗菌活性，并对Plasmodium falciparum具抗疟活性。然而，培养非依赖方法检测到的更广泛细菌群落与泰国TPSFs可培养放线菌种群之间的关系仍知之甚少。为此，本研究结合16S rRNA基因扩增子测序与培养依赖分离，表征泰国罗勇府热带泥炭沼泽森林林地表与湿地微生境的细菌群落组成与放线菌多样性，旨在更全面评估细菌与放线菌多样性，并评价TPSF土壤作为可培养放线菌来源用于进一步生物勘探的潜力。

研究方法：研究人员于2025年2月6日在泰国罗勇府Nong Chamrung泥炭沼泽森林（以Melaleuca cajuputi Powell为优势的沿海TPSF）无菌采集10份土壤样品（PT01–PT04、PT06–PT11），涵盖湿地（PT01–PT03）与林地表（PT04、PT06–PT11）两类微生境；PT05因与白蚁丘相关、理化性质与微生物群落异质性可能引入额外变异而被排除于下游分析，但保留原样品编号。主要关键技术方法包括：土壤总基因组DNA提取；16S rRNA基因V3–V4高变区扩增与Illumina MiSeq双端测序（2 × 250 bp）；基于QIIME 2 v2024.10与DADA2的序列质控、去噪与ASV推断，并导入MicrobiomeAnalyst v2.0进行多样性分析与统计检验（Chao1、Shannon、Bray–Curtis、PERMANOVA、LEfSe）；采用腐殖酸-维生素琼脂（HV agar）与淀粉-酪蛋白琼脂两种选择性培养基分离可培养放线菌，纯培养近全长16S rRNA基因扩增、Sanger测序、EzBioCloud比对及MEGA X最大似然系统发育分析。

研究结果：

3.1 样品特征：10份土壤样品来自湿地与林地表两类生态学上不同的微生境；湿地样品pH均一偏酸（5.16–5.41），林地表样品pH范围更宽（4.93–6.54）。

3.2 测序数据质量：经质控共获155,094条高质量序列读长，单样深度14,104–16,386条（均值15,509）；稀释曲线趋于平台，说明测序深度足以捕获属水平丰富度；去除单例后保留236个OTUs；林地表样品中PT04与PT07属水平丰富度最高，PT09最低；湿地样品中PT03、PT01、PT02丰富度最高。

3.3 热带泥炭沼泽森林微生物群落：门水平上，10份样品由Pseudomonadota（20.45%）、Actinomycetota（20.38%）、Acidobacteriota（12.26%）、Chloroflexota（11.94%）与Planctomycetota（10.26%）五个门主导；林地表样品组内变异较大，Actinomycetota相对丰度从10.69%（PT10）至56.18%（PT09）；合并分类单元后，Actinomycetota在林地表为26.43%、湿地仅6.25%，差异最大，可能与林地表较干燥、含氧较高有利于产孢、耐干燥的Actinomycetota有关；Pseudomonadota、Acidobacteriota、Planctomycetota、Verrucomicrobiota及Desulfobacterota、Nitrospirota、Myxococcota、Patescibacteria等厌氧或积水相关类群在湿地更丰富；Bacillota仅在林地表较丰富；WPS_2仅见于林地表样品（均值0.93%，PT11达3.79%），湿地完全缺失，提示生境特异性。

3.4 生境间α与β多样性：门水平Chao1在林地表均值18.14、湿地19.67，无显著差异（p = 1.000）；门水平Shannon均值分别为2.00与2.25，无显著差异（p = 0.383）；属水平Chao1均值分别为92.29与110.00，无显著差异（p = 0.568）；属水平Shannon均值分别为3.72与4.12，无显著差异（p = 0.383）。PT09在门与属水平均多样性最低（门Chao1 = 10、属Chao1 = 41；门Shannon = 1.32、属Shannon = 2.82），且pH最高（6.54），与其Actinomycetota优势（56.18%）一致。β多样性基于Bray–Curtis的PCoA与PERMANOVA显示，门水平生境间呈边缘不显著分化（F = 2.4061，R² = 0.231，p = 0.052；成对PERMANOVA p = 0.055），湿地样品在第一轴负值区聚集较紧，林地表样品更分散并部分重叠；属水平模式相似但更弱（F = 1.709，R² = 0.176，p = 0.089）。

3.5 生境间差异丰度类群：LEfSe分析中，门水平Actinomycetota判别效应最强（LDA = 5.00），是唯一具名义显著原始p值的门（p = 0.017），在林地表显著富集（264,300计数 vs 湿地62,471计数）；Bacillota（LDA = 4.13）与WPS_2（LDA = 3.67）亦富集于林地表；Pseudomonadota、Planctomycetota、Verrucomicrobiota、Desulfobacterota、Acidobacteriota等富集于湿地。属水平Acidothermus判别效应最高（LDA = 4.68），在林地表强富集（102,930计数 vs 湿地6,984计数），其次为未分类类群与Mycobacterium（LDA = 4.24），后者是唯一达名义显著的属（p = 0.030）；林地表富集属还包括FCPS473、Candidatus Udaeobacter、JG30_KF_CM66、Bacillus与Conexibacter；湿地富集属包括KD4_96、Candidatus Xiphinematobacter、Aminicenantales、Anaeromyxobacter等。经FDR校正后，上述顶级类群均未保持显著，仅门水平Actinomycetota与属水平Mycobacterium基于未校正p值达名义显著。

3.6 可培养Actinomycetota的分类组成与鉴定：Krona可视化显示Actinomycetota占全部细菌群落的19.76%，其中纲Actinobacteria最大（占Actinomycetota的52.85%），其次为Thermoleophilia（28.31%）与Acidimicrobiia（16.52%）。纲Actinobacteria内，目Frankiales最丰富（69%），几乎全由Acidothermus构成（占该纲68%，占Frankiales的99%）；其次为Mycobacterium（占该纲26%）；其余类群合计不足4%，包括Streptomycetaceae（1%）、未培养属（1%）、Micromonosporaceae（0.5%）等；Streptomycetaceae内31%的OTUs归为Streptomyces、22%归为Streptacidiphilus，其余47%仅能分类至科水平。培养依赖分离共获53株放线菌，代表八个属：Streptomyces（25株，47.17%，14个最近模式种）、Micromonospora（8株，15.09%）、Microbispora（8株，15.09%）、Kitasatospora（4株，7.55%）、Microtetraspora（3株，5.66%）、Nocardia（3株，5.66%，仅N. niigatensis）、Peterkaempfera griseoplana（1株，1.89%）与Gordonia terrae（1株，1.89%）；Streptomyces既最丰富又物种最丰富；10份样品中9份获分离株，PT06最多（13株），PT02次之（8株），PT04、PT08、PT11各7株，PT01未获菌株；最大似然系统发育树将53株菌解析为与八个属对应的支持良好的分支，各分离株与最近模式种紧密聚类。

讨论部分：TPSFs是全球碳储重要来源，具水饱和、低氧、酸性环境。罗勇府泥炭沼泽森林以Pseudomonadota、Actinomycetota、Acidobacteriota、Chloroflexota与Planctomycetota为优势，与Dom等对马来西亚砂拉越热带泥炭林24份泥炭土的研究（Acidobacteriota、Pseudomonadota、Actinomycetota、Bacillota合计占原核群落80–90%）及Kanokratana等对Pru Toh Daeng泥炭沼泽森林的研究（Pseudomonadota 30.7%、Acidobacteriota 24.8%、Verrucomicrobiota 6.2%、Planctomycetota 1.8%、Actinomycetota仅1.5%）大体一致。Actinomycetota在林地表比例更高，符合该门偏好通气土壤的一般特性，但本研究未测定相关条件；Ahmed等盐水土壤中Actinomycetota占21%，与本研究20.38%相近。α多样性在两类生境间无显著差异，β多样性呈非显著生境特异趋势（p = 0.052–0.055）；由于湿地3份、林地表7份样品，PERMANOVA统计功效低，应视为探索性分析。培养依赖与培养非依赖结果差异显著：Krona显示Streptomycetaceae仅占纲Actinobacteria的1%（Streptomyces占Actinobacteria属水平OTU丰度的0.40%），而Streptomyces占分离株47.17%；Acidothermus与Mycobacterium分别占纲水平OTU丰度的68%与26%，却完全未获培养；Kitasatospora、Microtetraspora、Nocardia、Peterkaempfera与Gordonia等培养获得的属未出现在宏基因组Krona前位类群中；Idris等亦报道Acidothermus在酸性土壤等环境样品中常为优势属，但因与生长更快的耐酸或中度嗜热细菌如Streptomyces竞争而难以在标准培养基中培养。WPS-2为尚未培养的候选细菌门，含Candidatus Eremiobacter，为最初描述于南极土壤的好氧细菌，被认为可进行大气化能合成，并与北方苔藓密切关联。土壤pH是本研究唯一测定的环境变量（4.93–6.54），PT09 pH最高且Actinomycetota相对丰度最高，提示可能存在关联；但扩增子数据为比例数据，优势类群份额上升可能仅为组成效应，且培养结果未反映该模式（PT09分离株少），丰度不能直接预测可培养性；pH变异与生境类型混杂，温度、土壤水分、有机质、养分有效性及生物相互作用等未评估，其贡献仍属推测。Streptomyces在培养中最多而扩增子中丰度低，除培养条件选择效应外，还可能涉及16S rRNA基因扩增子测序的方法学偏倚：PCR扩增偏倚可影响类群代表性，高GC含量与扩增效率降低及GC-rich细菌被低估相关，而Actinobacteria基因组GC含量高，可能造成Streptomycetaceae在本研究中代表性不足；但GC含量不太可能是唯一解释，因同样GC-rich的Acidothermus与Mycobacterium在同一数据集中占主导；DNA提取时产孢丝状Streptomyces细胞裂解不完全、引物错配及短扩增子分类分辨率有限等亦可能 contribut，但这些均未直接评估，仍属推测。两套数据重叠有限，主要在科水平（Streptomycetaceae与Micromonosporaceae）；培养非依赖方法提供更广泛细菌群落概览，培养依赖方法仅回收在特定培养条件下能生长的Actinomycetota，二者揭示不同但互补的多样性侧面。系统发育树中多数属级分支支持良好（81–99%），低于50%的bootstrap值主要出现在深部内部节点及近缘种间，尤其Streptomyces、Micromonospora与Microbispora，这与16S rRNA基因高度保守、近缘种核苷酸差异少及序列为部分长度（完整度≥70%）有关；低支持节点未用于推断关系，鉴定依赖与模式种的相似性及聚类。研究局限在于基于部分16S rRNA基因序列，种水平分辨率有限。培养依赖方法对获取分离株用于功能与生物技术研究必不可少，但仅捕获宏基因组测序所揭示放线菌多样性的一小部分；培养分离株与测序检测到的未培养类群间的显著差异表明，许多放线菌仍无法用常规培养技术获得，凸显创新培养方法之必要。

结论翻译：本研究结合培养非依赖与培养依赖方法，表征泰国罗勇府热带泥炭沼泽森林林地表与湿地土壤中细菌群落，重点关注Actinomycetota。与湿地样品相比，Actinomycetota在林地表样品中显著富集，提示林地表环境条件可能有利于该门成员的出现。总体α多样性在两类生境间无显著差异，而β多样性呈现未达统计显著的组成分离趋势。最显著的发现在于Actinomycetota的培养非依赖与培养依赖谱之间的明显差异：Acidothermus与Mycobacterium在测序谱中占主导，分别占纲Actinomycetes的68%与26%，但在53株培养分离株中基本缺失；相反，Streptomyces在培养依赖收集物中占主导，尽管其在测序谱中代表性极低。这些差异可能反映可培养性、生长需求与培养条件选择效应的差异，以及扩增子测序相关的方法学偏倚。总体而言，培养非依赖与培养依赖方法的互补使用可更全面理解热带泥炭沼泽森林土壤中的放线菌多样性；培养非依赖分析有助于识别常规培养代表性不足的类群，并可为改进稀有或难培养放线菌的分离策略提供指导。