《Bacteria》：Bacteriophage vB_SEEA3_AUVM_23KS1 and Its Endolysin as Biocontrol Agents Against Streptococcus equi subsp. equi, the Causative Agent of Strangles
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马腺疫（Strangles）是由马链球菌马亚种（Streptococcus equi subsp. equi，SEE）引起的马属动物重要接触性传染病，因抗菌治疗存在局限性及持续性携带状态而难以控制。本研究对噬菌体vB_SEEA3_AUVM_23KS1及其多组分
马腺疫（Strangles）是由马链球菌马亚种（Streptococcus equi subsp. equi，SEE）引起的马属动物重要接触性传染病，因抗菌治疗存在局限性及持续性携带状态而难以控制。本研究对噬菌体vB_SEEA3_AUVM_23KS1及其多组分内溶素（endolysin）PlyKS1作为抗SEE潜在生物防控剂进行了表征。vB_SEEA3_AUVM_23KS1基因组中未发现已知关注基因，在点滴试验（spot assay）中对124株来源多样的SEE分离株中的116株表现出裂解活性，而PlyKS1可裂解全部124株受试SEE分离株，包括噬菌体未能裂解的菌株。vB_SEEA3_AUVM_23KS1的宽宿主谱可能与其识别SEE间共享的细胞表面碳水化合物有关。两种制剂均可快速降低活菌数、抑制生物膜（biofilm）形成并减少已形成的生物膜生物量。将任一制剂与细菌接种物同时给药，均可显著提高大蜡螟（Galleria mellonella）感染模型中的存活率。该噬菌体在4 °C和25 °C下可保持稳定14天，提示具有良好的储存稳定性。此外，其在37 °C下放置24 h后仍保留大部分感染性，并在宽pH范围内保持稳定，支持其潜在的治疗应用。综上，上述发现值得进一步研究vB_SEEA3_AUVM_23KS1和PlyKS1作为抗SEE的互补性生物防控剂用于马腺疫管理。
马腺疫是由马链球菌马亚种（Streptococcus equi subsp. equi，SEE）引起的一种马属动物高度接触性传染病，在全球范围内广泛流行且具有重要临床意义。该病典型表现为急性发热、黏液脓性鼻漏以及下颌和咽后淋巴结的疼痛性脓肿。约10%的康复马匹会发展为无症状携带状态，SEE可在其喉囊中持续存在并间歇性排菌，成为全球持续传播和反复暴发的重要因素。尽管SEE通常对青霉素和其他β-内酰胺类敏感，但已有关于其对四环素类和大环内酯类等多种抗菌药物敏感性降低或耐药的报道；脓肿形成后全身抗菌治疗往往效果不佳，且可能延迟脓肿成熟，清除持续性喉囊感染亦十分困难；早期使用抗生素还可能损害长期保护性体液免疫的产生。此外，兽医领域抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance）日益严峻，多重耐药菌不断出现，且新型抗生素研发缓慢。这些因素共同凸显了开发不依赖传统抗菌药物的替代治疗与预防策略以阻断传播、改善马腺疫控制的必要性。
在此背景下，研究人员基于前期从污水中分离并获得全基因组序列的SEE噬菌体vB_SEEA3_AUVM_23KS1，开展了系统性研究。该噬菌体与链球菌噬菌体C1亲缘关系密切但具有独特的基因组特征，然而其杀菌与治疗潜力尚不明确。本研究通过比较基因组分析，并评估其稳定性、宿主谱、对生物膜相关细胞的杀菌活性以及在体内模型中的治疗潜力，明确了该噬菌体及其内溶素作为抗SEE生物防控剂的应用前景。研究结果表明，vB_SEEA3_AUVM_23KS1基因组中未发现已知毒力或抗菌药物耐药基因；其对124株SEE临床分离株中的116株（93.5%）形成裂解带，对全部15株马链球菌兽疫亚种（S. equi subsp. zooepidemicus，SEZ）亦有裂解作用；而PlyKS1可裂解全部124株SEE分离株，包括8株噬菌体不敏感菌株，并额外裂解化脓性链球菌（S. pyogenes）。两种制剂均能快速降低活菌数、抑制生物膜形成并减少已建立的生物膜生物量；在大蜡螟感染模型中与细菌共注射可显著改善幼虫存活率；噬菌体在4 °C和25 °C下14天保持稳定，在pH 4–10范围内稳定，但在马血清中感染性随时间下降。上述发现为将vB_SEEA3_AUVM_23KS1和PlyKS1开发为马腺疫管理的互补性生物防控剂提供了重要的实验基础，并为应对未来抗菌药物耐药性威胁提供了非抗生素治疗选择。
研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：采用比较基因组分析（GenomeMatcher和Geneious Prime软件）解析噬菌体基因组特征并筛查毒力与耐药基因；构建透明质酸荚膜缺陷株ATCC 33398ΔhasABC用于噬菌体增殖、滴度测定及酶谱分析（zymography）；利用大肠杆菌表达系统共表达ORF12–ORF14并纯化重组多组分内溶素PlyKS1，通过SDS-PAGE、native PAGE和酶谱法验证其活性；采用点滴试验和双层琼脂法测定噬菌体宿主谱与内溶素裂解谱；通过活菌计数、结晶紫染色生物膜抑制与破坏试验及大蜡螟（Galleria mellonella）感染模型评估杀菌与治疗潜力；利用高碘酸钠（NaIO
4）和蛋白酶K处理的热灭活菌体进行吸附试验以鉴定噬菌体受体。研究中使用的139株马链球菌（124株SEE和15株SEZ）来源信息详见表S1，SEE菌株分离年份为1975至2012年、地理来源多样，SEZ菌株于2002至2021年分离自日本；其他链球菌及大肠杆菌参考菌株来源亦在文中注明。
研究结果如下：
3.1 相关噬菌体的比较基因组分析：通过与四株相关链球菌噬菌体比较基因组分析，发现vB_SEEA3_AUVM_23KS1与C1等噬菌体在大部分保守基因组区域具有高度核苷酸序列一致性（约90%–95%），且含有与C1的holin和多组分内溶素系统同源的基因簇；基因组中未鉴定出已知毒力或抗菌药物耐药基因。
3.2 多组分内溶素的功能表征：通过共表达ORF12–ORF14并纯化重组复合物，SDS-PAGE显示PlyKS1由重链和轻链两个组分构成，native PAGE显示其主要以高分子量复合物形式迁移，酶谱分析仅在复合物位置检测到裂解活性，证实该多组分内溶素具有肽聚糖降解活性。
3.3 vB_SEEA3_AUVM_23KS1在不同环境条件下的稳定性：通过温度、pH和血清稳定性试验，发现噬菌体在4 °C和25 °C下14天滴度稳定，37 °C下1天仍保留90%以上感染性、7天降至56%、14天降至0.6%；50 °C下10 min内降至约10%，60 °C下10 min后检测不到感染性噬菌体；在pH 4–10范围内14天保持稳定；在马血清中12 h内降至初始值约1%，3天后不可检出。
3.4 vB_SEEA3_AUVM_23KS1和PlyKS1的裂解谱：通过点滴试验评估139株马链球菌及相关链球菌，发现噬菌体对124株SEE中的116株（93.5%）及全部15株SEZ形成裂解带，8株不敏感SEE菌株分离于1980至1997年的美国，其菌落表型与噬菌体敏感性无明确关联；PlyKS1裂解全部124株SEE（包括8株噬菌体不敏感株）及化脓性链球菌，但对无乳链球菌、停乳链球菌似马亚种和猪链球菌无活性，表明噬菌体宿主谱窄而局限于马链球菌，内溶素裂解谱略宽。
3.5 杀菌动力学及存活菌特征：通过48 h时间进程培养试验，发现噬菌体处理组3 h后菌数下降、12 h时部分样本检不出活菌，但24 h出现再生长并恢复至接近未处理对照水平；PlyKS1处理组和联合处理组杀菌动力学相似，3 h后检不出活菌并维持至12 h，24 h后菌数开始恢复，表明处理后细菌群体扩增显著延迟；48 h后再生长菌株对噬菌体和内溶素均保持敏感，培养上清中残余抗菌活性基本检测不到，提示再生长并非主要由稳定耐药驱动。
3.6 参与噬菌体感染的细菌因子鉴定：通过高碘酸钠和蛋白酶K处理热灭活菌体的吸附试验，发现蛋白酶K联合高碘酸钠处理后噬菌体吸附显著减少，提示参与噬菌体吸附的细菌成分为对高碘酸钠敏感的细胞表面碳水化合物（推测为C特异性碳水化合物群的GalNAc侧链）。
3.7 vB_SEEA3_AUVM_23KS1和PlyKS1治疗潜力的评估：通过结晶紫染色的生物膜抑制与破坏试验，发现噬菌体单用、内溶素单用及联合处理在两种起始接种密度下均显著减少生物膜形成，内溶素单用及联合处理在两种密度下均显著减少已形成生物膜生物量，噬菌体单用在1:1000稀释时显著而1:100稀释时不显著；在大蜡螟感染模型中，PBS对照组3天存活率为36.4%，氨苄西林组显著提高至77.3%，在独立实验中PBS对照组存活率为18.2%，而噬菌体组（70.0%）、内溶素组（90.0%）和联合组（90.0%）均显著改善幼虫存活率；未感染幼虫单独给予噬菌体、内溶素或PBS均无死亡，表明两种制剂在体外生物膜试验和体内昆虫感染模型中均展现治疗潜力。
讨论部分总结：本研究全面表征了vB_SEEA3_AUVM_23KS1，其与噬菌体C1亲缘密切但基因组序列存在差异，未发现已知毒力或耐药基因；与C1编码的独特多组分内溶素PlyC类似，vB_SEEA3_AUVM_23KS1编码的基因簇可形成有酶活性的复合物，表明该裂解系统在相关噬菌体间功能保守；噬菌体宿主谱局限于马链球菌，而PlyKS1在菌株水平上扩展了活性并额外裂解A群链球菌，二者种间活性相对狭窄，可能对马口腔和呼吸道常驻微生物群影响有限；噬菌体对SEE菌株的广覆盖可能与其受体性质（对高碘酸钠敏感的C特异性碳水化合物侧链）及SEE有限的遗传多样性有关，细胞壁靶点的功能约束和SEE的遗传同质性可解释噬菌体和内溶素对SEE分离株的广覆盖，提示单一噬菌体–内溶素组合可能无需多价鸡尾酒即可提供广覆盖，但耐药频率、机制和后果仍未知；荚膜形态本身并不决定噬菌体敏感性，生物膜可能提供额外持续机制，两种制剂对生物膜相关细菌的活性提示其治疗持续性喉囊感染的潜力，但本研究未直接评估其对喉囊软骨石内细菌的效力，需进一步体内研究；采用大蜡螟作为初始体内模型具有伦理和成本优势，两种制剂表现出与氨苄西林相似的 protective 效应，但昆虫缺乏哺乳动物型呼吸系统，仍需小动物呼吸道感染模型并最终在马中开展研究；噬菌体在4 °C和25 °C下14天及pH 4–10范围内稳定，而PlyKS1在37 °C肉汤中3天内活性丧失，两种处理后均出现细菌再生长且回收菌仍敏感，提示再生长并非主要由稳定耐药驱动，而可能与少量细菌存活及细菌依赖性活性丧失有关，马血清中感染性随时间下降，提示可能需要重复或序贯给药以维持抗菌活性；马腺疫仍造成显著动物健康和经济负担，噬菌体生物防控可能提供相对选择性的抑制SEE手段并减少抗菌药物使用，未来需建立安全性指南、最佳制剂、剂量和马体效力，并评估其对潜在耐药流行克隆的活性。
研究结论部分翻译：本研究证明了vB_SEEA3_AUVM_23KS1和PlyKS1对SEE的抗菌潜力。尽管SEE通常仍对一线抗菌药物敏感，但已有获得性耐药的报道，凸显了开发互补性治疗选择以加强对未来抗菌药物耐药性潜在上升的防范准备的价值。仍需进一步研究评估这些制剂的治疗适用性并扩展噬菌体衍生抗菌药物的储备。
