非典型苯丙氨酸解氨酶通过反馈激活和高植株稳定性增强植物苯丙烷类代谢产物合成

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Atypical phenylalanine ammonia-lyases that enhance phenylpropanoid production in plants

　　

植物合成多样且丰富的苯丙烷类（phenylpropanoids）天然产物，这些产物对植物适应环境至关重要，同时也为人类提供营养保健品和生物材料。这些化合物的合成始于关键酶苯丙氨酸解氨酶（Phe ammonia-lyase，PAL），该酶通常受到反馈抑制及其他调控机制的约束。本研究鉴定了一组此前未被表征的PAL，其在植株内（in planta）活性异常高。这些"非典型"（atypical）PAL为工程化改造植物苯丙烷类代谢途径的入口步骤提供了强有力的工具。植物合成多样的苯丙烷类化合物，为人类提供必需药物、营养物质和生物材料，同时作为全球主要碳汇发挥作用。苯丙烷类主要经PAL从L-苯丙氨酸（L-phenylalanine，Phe）衍生而来，PAL是一种高度受调控的酶活性，限制了苯丙烷类的产量。然而，不同植物物种如何调控PAL酶仍知之甚少。系统发育指导的生化筛选揭示了来自14种不同植物物种的PAL酶存在复杂多样的反馈调控。该筛选发现了一个此前未表征的PAL分支，即PALnc（noncanonical，非典型），其中部分成员在体外（in vitro）受对香豆酸（p-coumaric acid）、咖啡酸（caffeic acid）和4-羟基苯丙酮酸（4-hydroxyphenylpyruvic acid）的反馈激活。来自油棕（Elaeis guineensis，EgPALnc）和卡瓦胡椒（Piper methysticum，PmPALnc2）的两个PALnc基因在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中瞬时表达可提高苯丙烷类含量，这得到PALnc蛋白相较于典型PAL具有高植株内稳定性的支持。而拟南芥（Arabidopsis thaliana）PAL1（AtPAL1）在稳定拟南芥转基因株系中过表达导致AtPAL1蛋白积累极低且代谢效应微弱，导入EgPALnc则产生高含量EgPALnc蛋白和羟基肉桂酸衍生物的超积累。研究结果揭示了此前被忽视的多种植物苯丙烷类生物合成入口步骤调控的多样性，并鉴定PALnc分支中的非典型PAL作为缓解瓶颈和增强植株内苯丙烷类产量的宝贵工具。

**研究背景与问题提出**

苯丙烷类化合物及其衍生物是植物中一大类多样化的天然产物，在植物适应环境方面发挥关键作用。例如，类黄酮和羟基肉桂酸酯保护植物免受紫外线辐射，木质素提供机械强度并支持水分运输，香豆素和木脂素保护植物抵御病原体和食草动物，花青素色素和芳香挥发物对植物-昆虫通讯至关重要。许多植物来源的苯丙烷类化合物对人类也具有重要价值，如香草醛、抗氧化类黄酮和羟基肉桂酸衍生的生物聚合物。此外，酚类聚合物木质素和软木脂 resistant to microbial degradation，可改善大气CO₂在植物生物质中的长期封存。因此，提高植物中苯丙烷类含量既可增强作物价值，又有助于生物碳捕获和储存。

大多数植物合成苯丙烷类始于苯丙氨酸解氨酶（PAL）将芳香族氨基酸L-苯丙氨酸（Phe）不可逆脱氨生成反式肉桂酸，随后由细胞色素P450肉桂酸-4-羟化酶（C4H）产生对香豆酸。禾本科植物可通过双功能苯丙氨酸/酪氨酸解氨酶（PTAL）直接从L-酪氨酸（Tyr）生成对香豆酸。植物PAL在转录和转录后水平均受到高度调控。在蛋白水平，PAL受磷酸化、泛素化及26S蛋白酶体系统降解调控。此外，PAL酶活性受反式肉桂酸及多种其他酚类化合物的反馈抑制。

此前增加植株内苯丙烷类含量的尝试主要集中在增加Phe和Tyr的可用性上，这些氨基酸由上游莽草酸途径产生，其产量也受到严格调控。值得注意的是，莽草酸途径的第一个酶3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP）合酶在植物中受AAA及多种AAA衍生化合物的反馈抑制，限制了可用于苯丙烷类生产的Phe量。DAHP合酶的严格反馈调控可通过其变构调控结构域的点突变（即sota突变）来缓解，导致植物超积累莽草酸和AAA（主要是Phe）。然而，表达sota突变DAHP合酶的拟南芥植株中类黄酮、芥子酰衍生物和木质素含量并未增加。相反，此前在多种植物宿主中表达来自细菌的反馈不敏感DAHP合酶的研究在增强苯丙烷类生产方面结果不一。总体而言，这些研究表明Phe向苯丙烷类的转化仍高度受限，可能由于靶向PAL的多重调控机制。因此，分析不同植物物种中PAL的调控可能为增强植株内苯丙烷类生产提供有用见解。

**研究开展与主要结论**

为探索不同植物中PAL的生化调控，研究人员进行了系统发育指导的多种植物谱系PAL酶表征。研究揭示不同植物的PAL酶受到复杂多样的反馈调控，并进一步发现此前未识别的非典型分支中的两个酶被下游苯丙烷类（包括咖啡酸）激活。这些反馈激活的"非典型"PAL与通过表达sota突变DAHP合酶增强Phe前体供应相结合，在本氏烟草叶片和拟南芥植株中实现了积累的AAA向苯丙烷类的高效转化。这些非典型PAL为缓解苯丙烷类生物合成入口步骤的瓶颈和增强植物苯丙烷类生产提供了强有力的工程工具。

**关键技术方法**

研究人员开展了以下主要关键技术工作：（1）对广泛陆生植物物种的PAL/PTAL家族进行最大似然系统发育分析；（2）使用重组蛋白进行酶动力学分析和反馈调控筛选，采用¹³C标记底物结合液相色谱-质谱联用（LC–MS）监测产物形成；（3）在本氏烟草叶片中进行瞬时表达分析，结合反馈不敏感AtDHSsotaB4共表达以增强Phe供应；（4）在拟南芥Col-0和sotaB4突变体背景中构建稳定转基因株系，使用三种天然启动子（PAtRbc、PAtC4H、PAtDHS1）驱动EgPALnc表达；（5）靶向LC–MS代谢物定量和基于MZmine v4.1.0的非靶向代谢组学分析，结合MS2数据化学结构预测和天然产物分类器（NPC）通路分类。

**研究结果**

**许多植物具有非典型但功能性的PAL酶。** 通过广泛陆生植物物种PAL/PTAL家族的系统发育分析，研究人员发现植物PAL/PTAL分布于两个主要分支——"典型"和"非典型"分支。所有分析植物物种的基因组均含有至少一个典型分支基因，包括此前充分表征的PAL和PTAL酶。相反，非典型PAL（PALnc）序列在许多被子植物中缺失，包括禾本科和十字花科等研究充分的分类群。尽管典型与非典型PAL之间初级序列同一性相对较低（约60%），多序列比对表明关键活性中心残基高度保守。计算机建模支持典型PAL与PALnc酶之间高度相似的折叠和关键催化残基的保守性。酶学 assay 使用重组PAL/PTAL以Phe为底物证实所有酶均为功能性PAL，包括测试的四个PALnc，尽管其活性低于典型PAL。PALnc酶对Tyr和L-DOPA仅显示残余活性，未检测到组氨酸解氨酶活性，反向反应中仅检测到痕量Phe产生，强烈支持PALnc酶优先催化Phe脱氨。酶动力学分析显示PALnc酶对Phe的K_m较高、k_cat较低，催化效率约1 s^?1 μM^?1，比典型PAL低20倍以上，仅棉属GrPALnc的动力学参数与典型PAL相当。

**不同植物的PAL和PTAL酶受到多样反馈调控。** 研究人员筛选了早期苯丙烷途径中间产物反式肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸在底物饱和条件下对PAL和TAL活性的影响。大多数测试的PAL酶受反式肉桂酸强烈抑制（75%–95%），部分（包括AtPAL1和AtPAL2）也受咖啡酸抑制（约50%），但不受对香豆酸或阿魏酸抑制。PTAL的PAL活性也受反式肉桂酸、对香豆酸和咖啡酸强烈抑制，并受阿魏酸适度抑制，而其TAL活性仅受对香豆酸强烈抑制和咖啡酸适度抑制。四个测试的PALnc酶中，GrPALnc和PmPALnc1显示与典型PAL相似的抑制谱，包括受反式肉桂酸强烈抑制（85%–90%）。相反，EgPALnc和PmPALnc2对反式肉桂酸抑制的敏感性降低（仅30%–50%抑制），甚至在对香豆酸和咖啡酸存在下显示高达50%的活性增加。此外，EgPALnc和PmPALnc2对丙酮酸苯酯（PPY）抑制的敏感性较低，并受4-羟基苯丙酮酸（4HPPY）激活。这些结果表明PAL酶对多种Phe和Tyr衍生代谢物的抑制敏感性存在差异。

**EgPALnc和PmPALnc2酶显示非典型反馈调控并受咖啡酸激活。** 通过测定不同浓度反式肉桂酸（50–1,000 μM）下的PAL活性进行定量分析，典型PAL受反式肉桂酸强烈抑制，IC₅₀为150–290 μM或约300–500 μM。相反，所有四个测试的非典型PAL以及AtPAL2和PpPAL2显示更高的IC₅₀值，约为或超过1 mM反式肉桂酸，其中EgPALnc和PmPALnc2的IC₅₀最高，超过1.3 mM。考虑到其对Phe的K_m，EgPALnc和PmPALnc2中反式肉桂酸的计算抑制常数K_i远高于AtPAL1和JaPAL。除对反式肉桂酸抑制的敏感性降低外，EgPALnc和PmPALnc2在1 mM咖啡酸存在下显著更具活性。在约500 μM咖啡酸下，AtPAL1受约50%抑制，而EgPALnc和PmPALnc2被激活超过60%，进一步支持某些PALnc酶在体外 exhibit 非典型反馈调控。

**非典型PAL在本氏烟草叶片中高效将AAA转化为苯丙烷类。** 研究人员在本氏烟草叶片中瞬时表达反馈激活的EgPALnc和PmPALnc2、非典型但受反馈抑制的PmPALnc1以及典型且受反馈抑制的AtPAL1和AtPAL4，以红色荧光蛋白（RFP）为阴性对照。浸润后4天LC–MS分析显示，浸润EgPALnc、PmPALnc1和PmPALnc2的叶片中Phe含量显著降低，但苯丙烷类含量未增加。研究人员推测这可能是由于本氏烟草叶片中PAL底物Phe的可用性降低。为克服这一潜在限制，研究人员将各种PAL构建体与表达拟南芥反馈不敏感突变DAHP合酶（AtDHSsotaB4）的构建体共浸润。单独表达AtDHSsotaB4与RFP阴性对照相比，Phe和Tyr含量分别大幅增加约125倍和35倍，4HPPY含量也如此。相反，AtDHSsotaB4与PAL基因共表达导致Phe、Tyr和4HPPY含量总体下降趋势，对PmPALnc2尤为显著。值得注意的是，与仅表达AtDHSsotaB4相比，EgPALnc和PmPALnc2的表达强烈增加对香豆酸和咖啡酸含量，并较小程度增加阿魏酸含量。此外，表达EgPALnc和PmPALnc2的组织显示绿原酸（即咖啡酰奎宁酸）平均增加50%。值得注意的是，浸润AtPAL1或PmPALnc1的叶片中这些苯丙烷类未显著增加，而AtPAL4浸润仅导致轻微增加。时间进程实验表明，PmPALnc2（而非PmPALnc1）与AtDHSsotaB4共表达从浸润后第2天起在多个时间点大幅降低Phe、Tyr和4HPPY的积累，并导致对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸的渐进性超积累。总体而言，代谢物含量变化表明这些非典型PAL（EgPALnc和PmPALnc2）在植株内比其他测试的PAL更具活性。

**高苯丙烷类产量与非典型PAL植株内蛋白丰度增强相关。** 通过RT-qPCR使用靶向FLAG标签的单一引物对测量PAL转录本丰度，显示所有PAL基因均有表达，非典型EgPALnc、PmPALnc1和PmPALnc2转录本丰度约为AtPAL1的两倍。尽管差异显著，但相较于EgPALnc和PmPALnc表达对代谢物含量的实质性影响，这些差异较小。通过免疫印迹使用抗FLAG抗体定量PAL蛋白丰度，揭示PAL间差异比RT-qPCR转录本数据更为显著。AtPAL1和AtPAL4蛋白分别积累至每克鲜重10和15 μg，而EgPALnc和PmPALnc2平均达到50 μg/gFW。PmPALnc1尽管在植株内对代谢物含量无显著影响，但积累至约30 μg/gFW。总体而言，PAL蛋白丰度与PAL转录本丰度相关性较差。不同PAL的蛋白丰度与对香豆酸和咖啡酸含量呈正线性相关（PmPALnc1除外），表明PmPALnc1在植株内活性不高，可能由于其低k_cat和/或受多种效应物的实质性反馈抑制。总之，这些发现表明EgPALnc和PmPALnc2样品中高苯丙烷类产量至少部分由这些蛋白相较于典型PAL的植株内丰度增加所支持。

**AAA过量产生挽救EgPALnc转基因拟南芥植株的生长受损。** 为研究在稳定转基因植物中表达非典型PAL的影响，EgPALnc基因在拟南芥野生型Col-0以及超积累Phe和其他AAA的sotaB4突变体植株中表达。为精细调控转基因表达，EgPALnc在三种拟南芥天然启动子控制下表达：RuBisCO S3B（PAtRbc）用于叶肉高表达；肉桂酸4-羟化酶（PAtC4H）用于与苯丙烷途径共表达；AtDHS1（PAtDHS1）用于与莽草酸途径共表达。当T1转基因种子种植于土壤并进行基因分型时，研究人员检测到部分PAtRbc-EgPALnc株系和所有PAtC4H-EgPALnc株系的T-DNA盒被截短，尽管相应的农杆菌克隆仍具有完整的T-DNA。因此，观察到的截短可能发生在转化后的植株内。少数PAtRbc-EgPALnc转基因株系仍可恢复，但显示黄化和生长延迟迹象。因此，进一步工作仅使用PAtDHS1-EgPALnc株系，因其显示较轻的表型。研究人员在Col-0和sotaB4背景中各自分离了五个独立的PAtDHS1-EgPALnc T3同型合子单插入株系。为进行功能比较，研究人员还在Col-0和sota背景中产生了在PAtDHS1控制下过表达AtPAL1的植株，各分离五个独立的T3同型合子单插入株系。为比较EgPALnc和AtPAL1表达对这些稳定转基因植物发育的影响，四个独立的T3同型合子株系在? Murashige-Skoog培养基上并排萌发。AtPAL1株系与未转化的sota和Col-0植株在视觉上无法区分，而大多数Col-0_EgPALnc植株显示急剧延迟生长和低萌发率。相反，sota_EgPALnc株系在萌发后2周仅显示莲座质量的适度减少。当从2周龄植株的整个莲座提取可溶性代谢物时，多个独立EgPALnc株系显示与对照Col-0和sotaB4植株相比高达4倍的紫外范围吸光度，表明酚类含量升高。值得注意的是，sotaB4_EgPALnc株系比Col-0_EgPALnc株系生长好得多，表明EgPALnc过表达对拟南芥植株生长的有害影响被sotaB4背景中的高AAA可用性所缓解。

**表达EgPALnc的拟南芥植株超积累早期苯丙烷途径中间产物。** 研究人员通过LC–MS分析2周龄在PAtDHS1控制下表达AtPAL1或EgPALnc的植株，以确定AAA和苯丙烷途径中间产物的含量。EgPALnc株系与其对应的未转化Col-0或sotaB4对照相比Phe和Tyr含量较低，这与高PAL活性一致。这种Phe和Tyr含量的降低在sotaB4背景中尤为明显。尽管更为温和，研究人员在AtPAL1株系中也观察到类似效应。此外，EgPALnc株系——尤其在sotaB4背景中——显示早期苯丙烷途径中间产物如对香豆酸和阿魏酸含量急剧增加，与未转化Col-0或sotaB4对照相比高达100倍。5-羟基阿魏酸和芥子酸也观察到显著增加，尽管强度较低。反式肉桂酸和咖啡酸含量在所有样品中均低于检测水平。与EgPALnc株系相反，AtPAL1株系未显示这些苯丙烷类中任何一个的统计学显著增加，仅在AtPAL1_sotaB4株系中观察到芥子酸的适度增加。为评估EgPALnc表达是否增加其他苯丙烷类，研究人员进行了非靶向代谢物分析以比较sotaB4与sotaB4_EgPALnc或sotaB4_AtPAL1转基因株系。该非靶向方法伴随使用MS2数据的化学结构预测以将推定化合物身份分配给检测到的质量特征。分析在所有植物样品中鉴定出879个质量特征。其中，131个特征在sotaB4_EgPALnc株系中与未转化sotaB4相比显著增加（≥2倍增加，P值<0.01），而57个特征降低≤0.5倍。相比之下，sotaB4_AtPAL1株系中仅14个特征显著增加，支持EgPALnc表达对代谢物含量的影响更强。从sotaB4_EgPALnc株系中富集的131个特征中，95个具有基于MS2的分子结构预测。根据天然产物分类器（NPC）通路和类别，这些富集特征主要（约65%）分类为"莽草酸和苯丙烷类"，特别是"肉桂酸及其衍生物"（约50%），其次是"简单香豆素"和"查尔酮"（分别约7%和4%）。sotaB4_EgPALnc株系中降低的特征以氨基酸及相关代谢物为主，可能由于EgPALnc对Phe的高消耗。sotaB4_EgPALnc株系中最高度富集的特征主要对应于四组相关特征，预测为对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸的葡萄糖苷。这些推定的羟基肉桂酸葡萄糖苷在sotaB4_EgPALnc株系中的丰度分别比AtPAL1和未转化sotaB4株系高>100倍和>1,000倍。羟基肉桂酸的高积累与sotaB4_EgPALnc植株提取物在约330 nm处吸光度增加一致。这些发现支持EgPALnc表达有效将sotaB4植株中超积累的Phe前体转化为早期苯丙烷途径中间产物，主要以葡萄糖苷形式存在。

**成年EgPALnc转基因植株不超积累类黄酮。** 为评估EgPALnc表达是否也能在成年拟南芥植株中产生高产量苯丙烷类及其衍生代谢物，三个独立的同型合子sotaB4_EgPALnc和sotaB4_AtPAL1株系在土壤中于对照光强（约100 μmol·m^?2·s^?1）下生长5周，然后转移至强光条件（750 μmol·m^?2·s^?1）3天以诱导色素产生。与之前在体外生长的幼株中观察到的类似，sotaB4_EgPALnc株系成熟叶片可溶性代谢物提取物的吸光度谱显示在紫外范围吸收升高，在花青素范围也较小程度升高。靶向LC–MS代谢物分析显示sotaB4_EgPALnc株系与sotaB4相比Phe和Tyr含量降低，并积累对香豆酸、阿魏酸和较小程度的芥子酸，如之前在幼株中观察到的。这些样品中咖啡酸含量低于检测水平。此外，推定的对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸葡萄糖苷在sotaB4_EgPALnc株系中也积累至非常高水平。然而，芥子酸缀合物芥子酰-O-葡萄糖苷和芥子酰苹果酸在sotaB4_EgPALnc株系中与sotaB4和sotaB4_AtPAL1株系相比显示相对较低的增加。强光处理诱导黄酮醇和花青素的产生。然而，LC-MS定量叶中高度丰富的花青素A10和A11显示基因型间无差异，而其他花青素在sotaB4_EgPALnc和sotaB4_AtPAL1株系中甚至比sotaB4降低。类似地，槲皮素和山奈酚衍生的黄酮醇在各基因型间水平相当。这些样品的非靶向代谢组学支持成年sotaB4_EgPALnc植株中超积累的约70%代谢特征对应于苯丙烷类，主要是羟基肉桂酸衍生物。因此，EgPALnc转基因植株超积累早期苯丙烷途径中间产物及其衍生物，对下游类黄酮的影响相对较小。为检测AtPAL1和EgPALnc的差异效应是否由基因表达差异引起，研究人员对相同植物样品进行RT-qPCR分析，显示AtPAL1和EgPALnc转录本丰度总体相当。尽管表达水平相当，通过免疫印迹定量这些相同样品中AtPAL1-FLAG和EgPALnc-FLAG蛋白显示，AtPAL1蛋白在标准光照条件下积累至极低水平（0.5–1 μg/gFW），强光处理后变得更丰富（2–6 μg/gFW）。相比之下，EgPALnc蛋白在对照光照条件（约15–25 μg/gFW）和强光（约30 μg/gFW）下均积累至高水平。这些蛋白丰度的显著差异与转录本丰度相关性较差。总之，这些结果揭示EgPALnc表达产生高含量EgPALnc蛋白和植株内多种早期苯丙烷中间产物及其衍生物的超积累。

**讨论部分总结**

此前研究表明，解除莽草酸途径催化步骤（DAHP合酶）调控导致AAA和某些AAA衍生化合物超积累，但不导致苯丙烷类超积累。类似地，通过解除拟南芥Phe生物合成最后步骤（预苯酸脱水酶）调控实现Phe过量产生主要增加Phe衍生硫代葡萄糖苷而非苯丙烷类。相反，在拟南芥中表达反馈不敏感细菌DAHP合酶或预苯酸脱水酶导致单木脂醇途径中间产物含量有意义增加。其他通过过表达PAL增加苯丙烷类含量的尝试成功程度不一。这些不同研究和植物模型中的对比输出突显了Phe和苯丙烷代谢界面处的复杂调控。

自1961年发现以来，PAL酶已从许多植物物种中进行生化表征。然而，这些研究仅限于典型分支内的PAL/PTAL酶，可能因为PALnc酶在大多数模式植物物种如拟南芥、二穗短柄草以及豆科和禾本科作物中缺失。本研究中鉴定的PALnc酶的表征显示它们在体外和植株内均有活性，部分 exhibit 与典型PAL相比可能有利于生物工程应用的独特性质。

典型PAL/PTAL酶显示可比的动力学参数，如此前报道受反式肉桂酸和其他苯丙烷类抑制，尽管程度不同。PAL和PTAL酶受这些AAA衍生代谢物的反馈调控可能有助于严格控制碳流入苯丙烷途径。酶动力学分析显示非典型酶如EgPALnc和PmPALnc2显著低于典型PAL的效率；然而，这些PALnc酶也更耐受反馈抑制，如其对反式肉桂酸的较高K_i值所示。这些结果表明底物结合效率与抑制敏感性之间存在权衡。计算机建模分析揭示典型PAL和PALnc酶之间保守的整体结构，尽管 minor 结构差异如PALnc中延长的C末端可能影响配体结合。值得注意的是，EgPALnc和PmPALnc2在1 mM反式肉桂酸或PPY（两者均为典型PAL的强抑制剂）存在下保留超过50%的活性。此外，EgPALnc和PmPALnc2被咖啡酸和4HPPY激活而非抑制。咖啡酸此前曾被报道激活从叶芥菜中纯化的PAL酶，尽管非典型PAL似乎在十字花科中缺失。

此外，EgPALnc和PmPALnc2蛋白在本氏烟草和拟南芥中表达时以相对较高的丰度积累，进一步促进Phe向苯丙烷类的转化。相反，AtPAL1和AtPAL4蛋白的丰度始终远低于EgPALnc和PmPALnc2，尽管其转录本丰度相当。因此，除体外反馈调控差异外，EgPALnc和PmPALnc2蛋白的高植株内稳定性似乎是其对苯丙烷类产量强烈影响的重要因素。这些结果表明某些非典型PAL可能绕过促进PAL蛋白植株内泛素化和降解的翻译后调控机制，这些机制由多种含kelch基序的F-box（KFB）蛋白介导。考虑到典型和非典型PAL之间初级序列同一性低，A. thaliana和N. benthamiana（缺乏任何PALnc直系同源物的物种）中靶向内源PAL降解的KFB蛋白可能无法与外源PALnc蛋白相互作用。

研究人员对过表达EgPALnc的拟南芥植株的LC–MS分析显示一般苯丙烷途径中间产物的积累，包括对香豆酸和阿魏酸及其可能的葡萄糖苷衍生物。这些糖基化形式可能代表来自途径中间产物溢出的储存或解毒产物。然而，这些转基因株系似乎并未增加类黄酮含量，即使在促进其生物合成的强光条件下。菜豆PAL2（典型PAL）在烟草植株中过表达提高了糖基化对香豆酸含量，但未提高类黄酮芦丁。相反，黄芪PAL1（也是典型PAL）在烟草中过表达导致类黄酮槲皮素含量增加5倍。最近在拟南芥中的报道观察到异源表达PAL基因后总类黄酮含量增加（大多数情况下基于粗提物的分光光度测定）。这些研究和研究人员自己的发现支持PAL是苯丙烷生物合成的关键控制点，并且解除PAL瓶颈后，其他下游酶可能根据环境和植物宿主成为限制因素。EgPALnc株系中类黄酮产量有限的 other 潜在原因可能包括EgPALnc无法与内质网锚定的P450酶相互作用，这些酶被假设将代谢流引导至类黄酮途径。或者，EgPALnc株系中缺乏黄酮醇超积累和某些花青素减少可能 convey 其降解途径的激活，这些途径仍未被鉴定。

虽然像EgPALnc和PmPALnc2这样的非典型PALnc酶为解除苯丙烷生物合成入口步骤瓶颈提供了宝贵工具，但EgPALnc过表达在Col-0中造成严重有害效应。然而，这些发育缺陷在sotaB4突变体背景中减弱，该背景由于解除内源DAHP合酶调控的点突变而超产AAA。这一发现表明EgPALnc异源表达耗尽AAA或其非苯丙烷衍生代谢物（如质体醌生物合成所需的HGA），导致WT背景中的发育问题。因此，将莽草酸途径工程（增加Phe供应）与反馈激活且稳定的PALnc酶的精细调控表达相结合是增强植株内苯丙烷类产量而不损害整体产量的有前景方法。此类植物底盘的开发将为多种苯丙烷类的可持续高效生产打开大门。

**研究结论翻译**

研究结果揭示了此前被忽视的多种植物苯丙烷类生物合成入口步骤调控的多样性，并鉴定PALnc分支中的非典型PAL作为缓解瓶颈和增强植株内苯丙烷类产量的宝贵工具。