《International Journal of Biological Macromolecules》：CircRNA9389 inhibits NKRF nuclear translocation to activate the NFκB pathway and upregulate PD-L1 expression promoting colorectal cancer progression
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摘要背景环状RNA（circRNAs）在调节多种癌症的进展和癌症免疫微环境方面发挥着关键作用。然而，circRNAs如何影响结直肠癌（CRC）的发病和发展以及肿瘤免疫的分子机制仍有待深入探索和阐明。方法我们通过高通量测序鉴定了一种新的与CRC相关的circRNA（circRNA9
摘要
背景
环状RNA（circRNAs）在调节多种癌症的进展和癌症免疫微环境方面发挥着关键作用。然而，circRNAs如何影响结直肠癌（CRC）的发病和发展以及肿瘤免疫的分子机制仍有待深入探索和阐明。
方法
我们通过高通量测序鉴定了一种新的与CRC相关的circRNA（circRNA9389）。使用Sanger测序和带有收敛及发散引物的DNA电泳确认了circRNA9389的环状结构。通过定量实时PCR（qRT-PCR）研究circRNA9389在癌组织和邻近组织中的表达情况及其与PD-L1表达的相关性。利用CRC细胞和动物模型评估circRNA9389对CRC增殖和转移的影响。通过Western blotting（WB）、RNA免疫沉淀（RIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）和双报告基因检测实验来探讨circRNA9389促进CRC进展和PD-L1表达的机制。
结果
circRNA9389来源于天冬氨酸β-羟化酶（ASPH）基因，在CRC组织中显著上调，其高表达水平与晚期TNM分期相关。circRNA9389的表达与PD-L1 mRNA的表达呈强正相关。circRNA9389的过表达促进了CRC细胞的增殖、转移和侵袭，而其抑制则产生相反的效果。机制上，circRNA9389与NKRF蛋白R3H结构域的非经典核定位信号（NLS）结合，从而阻断其核转运，激活NF-κB信号通路并上调PD-L1表达。此外，NF-κB通路中的p65与ASPH基因的P2 promoter区域结合，增强了circRNA9389的合成。
结论
我们的研究鉴定了一种新的circRNA（circRNA9389），并揭示了circRNA9389促进CRC进展的机制。总体而言，circRNA9389可能成为CRC治疗的新靶点。
引言
结直肠癌（CRC）是全球研究最广泛的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均较高[1]，[2]。最新研究表明，到2030年后，全球疾病负担将增加约60%，导致超过220万新病例和110万死亡病例[3]。大多数CRC患者在晚期才被诊断出来，5年生存率仅为13.1%[4]。因此，改善CRC患者的预后、阐明其分子机制以及发现新的治疗靶点显得尤为紧迫。
环状RNA（circRNAs）是一类通过反向剪接形成的新型RNA分子，最早在20世纪70年代分析RNA病毒时被发现[5]。随着高通量测序技术的进步，circRNAs的研究取得了进展[6]。竞争性内源性RNA（ceRNA）假说是目前认为circRNAs发挥调控作用的主要机制[7]。例如，circCCT3通过竞争性结合miR-613来促进CRC的转移，从而增强VEGFA和WNT3的表达[8]。此外，circRNAs还通过外泌体在肿瘤微环境中的细胞相互作用中发挥重要作用。例如，胶质瘤细胞通过携带circNEIL3的外泌体促进肿瘤相关巨噬细胞获得免疫抑制表型，从而促进胶质瘤的进展[9]。circRNAs还可以与RNA结合蛋白和其他蛋白质相互作用，参与多种生物过程[10]，[11]，它们可以调节基因转录，影响细胞增殖和生长[12]。circRNAs还与CRC的增殖、转移、药物耐药性和血清外泌体有关，凸显了其重要的研究价值[13]。
免疫检查点抑制剂（ICIs）显著改变了CRC的治疗策略，使一些晚期CRC患者实现了肿瘤完全缓解。针对PD-1/PD-L1通路的ICIs被推荐作为转移性错配修复缺陷和高微卫星不稳定（dMMR/MSI-H）CRC的一线治疗[14]，[15]，[16]，以及非转移性dMMR/MSI-H CRC的新辅助治疗[17]，[18]。最新研究表明，circRNAs参与多种抗肿瘤免疫反应和免疫细胞调节。在对ICIs治疗有反应和无反应的黑色素瘤患者中，circRNAs的表达谱存在显著差异，基于circRNAs的签名（ICBcircSig）能够有效预测ICIs的治疗效果[19]。尽管有研究指出circTMTC3和circFAM117B可以通过miR-142-5p/PD-L1轴上调PD-L1表达[19]，但关于circRNAs与免疫检查点分子之间调控关系的研究仍有限。
在本研究中，我们鉴定了一种新的与CRC相关的circRNA，命名为circRNA9389，它是通过天冬氨酸β-羟化酶基因（ASPH）的外显子2和3的反向剪接形成的。circRNA9389在CRC组织中上调，其与PD-L1 mRNA的表达呈正相关。机制上，p65结合ASPH的P2 promoter区域，促进circRNA9389的形成。circRNA9389与NF-κB抑制因子（NKRF）蛋白R3H结构域的非经典核定位信号（NLS）序列相互作用，抑制其核转运，从而激活NF-κB信号通路并上调PD-L1表达，促进CRC进展。敲低circRNA9389的表达可抑制裸鼠皮下CRC肿瘤的大小。我们的研究为CRC的发病机制和潜在治疗靶点提供了新的见解。
章节片段
circRNAs转录组测序
从中山大学第一附属医院胃肠外科收集了六对新鲜CRC组织和相邻正常组织样本，并送至杭州联川生物技术有限公司进行circRNAs转录组测序。随后，对原始测序数据进行了校正和注释，以获得circRNA表达谱和差异表达基因。所有患者均签署了知情同意书，研究得到了伦理委员会的批准
circRNA9389在结直肠癌中上调并具有环状特征
为了识别CRC中差异表达的circRNAs，我们对六对CRC组织和相邻正常组织进行了高通量测序。在CRC组织中发现了501个上调和403个下调的circRNAs（log|fold change| > 1，p值 < 0.05）（图1A）。KEGG分析表明，差异表达circRNAs的宿主基因主要富集在以下通路中：细胞运动相关通路（如粘附连接、肌动蛋白调节等）
讨论
先前的研究表明，circRNAs参与CRC中的多种生物过程。例如，在具有肝转移的CRC患者的肿瘤和血清样本中发现了一种N6-甲基腺苷（m6A）修饰的circNSUN2，其高表达与不良预后相关。circNSUN2在PDX转移模型中促进了肝转移，并在体外增强了癌细胞的侵袭性。这一机制涉及circNSUN2的m6A修饰，增加了其向
结论
总之，circRNA9389与NKRF蛋白的R3H结构域结合并掩盖了该结构域内的NLS，从而激活NF-κB通路并上调PD-L1表达。此外，p65结合ASPH的P2 promoter区域，进一步促进了circRNA9389的生成。针对circRNA9389可能成为CRC的治疗策略。
CRediT作者贡献声明
王辉：概念化。冯伟：概念化。刘文伟：概念化。李武国：验证、方法学、研究、数据管理。周叶浩：概念化。张永新：数据管理。王晓峰：资源获取。雷天祥：软件处理。唐乔：验证。杨婷：可视化。吴旭：方法学。苏桥：写作 - 审稿与编辑、方法学、研究、概念化。宋吴：写作 - 审稿与编辑、项目管理、资金支持
伦理批准和参与同意
该研究获得了中山大学第一附属医院伦理委员会的批准（批准编号（2021）687）。
资助
本工作得到了国家自然科学基金（82573282, 82070529）、广东省自然科学基金（2021A1515010791, 2025A1515011210）、广东省医学科学研究基金（A2024139）、广州市区域临床高新技术与重大技术创新项目（2024P-ZD27）、湖北省自然科学基金（2023AFB180）以及广东省工程研究中心的支持
利益冲突声明
作者声明本研究在没有任何可能被解释为利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。
王辉|冯伟|刘文伟|李武国|周叶浩|张永新|王晓峰|雷天祥|唐乔|杨婷|吴旭|苏桥|宋吴
