乙型肝炎病毒X蛋白有助于乙型肝炎核心抗原的摄取和呈递，从而增强针对HBV相关肿瘤的核心抗原特异性CD4 T细胞免疫

《International Journal of Biological Macromolecules》：Hepatitis B virus X protein facilitates hepatitis B core antigen uptake and presentation to enhance core antigen-specific CD4 T-cell immunity against HBV-associated tumor

　　

摘要

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染的特点是病毒特异性免疫力较弱且功能失调，这限制了现有抗病毒疗法的效果。包含多种HBV抗原的治疗性疫苗可能会增强免疫反应，但病毒抗原之间的物理关联是否影响疫苗的免疫原性仍不清楚。在这里，我们发现重组HBV X蛋白（rHBx）在测试条件下虽然未能诱导出可检测到的HBx特异性抗体或T细胞反应，但它可以作为HBc149病毒样颗粒（rHBc149）的免疫调节伴侣。生化和生物物理分析证实rHBx与rHBc149之间存在可重复的关联，形成了更高阶的抗原复合物。这种复合物的形成和共同递送增强了抗原呈递细胞对rHBc149的摄取，增加了其向引流淋巴结的转运，并促进了树突状细胞的激活。用rHBx+rHBc149复合物进行免疫可以增强HBc特异性抗体和CD4⁺ T细胞的反应，并产生平衡的Th1/Th2免疫谱型。重要的是，在HBV抗原相关的肿瘤模型中，给予预形成的复合物比分别在不同部位递送这两种抗原更能有效地控制肿瘤。这种抗肿瘤效应需要CD4⁺和CD8⁺ T细胞以及MHC II类限制的抗原呈递。这些发现表明抗原-抗原关联是一种机制，通过这种机制，一种非免疫原性的病毒蛋白可以增强另一种抗原的摄取、呈递和免疫原性，这支持将HBx作为基于HBc的治疗性疫苗的模块化伴侣。

引言

乙型肝炎病毒（HBV）感染仍然是全球主要的健康负担，是肝硬化和肝细胞癌（HCC）的主要原因[1] [2]。尽管基于HBsAg的预防性疫苗能够通过诱导中和性抗-HBs抗体有效预防新的HBV感染[3] [4] [5]，但它们不能恢复慢性HBV（CHB）患者的抗病毒免疫力。目前的抗病毒疗法可以抑制病毒复制[6] [7]，但很少能实现功能性治愈[8] [9]，主要是因为HBV特异性T细胞反应仍然较弱、耗竭或方向狭窄[10] [11] [12]。因此，迫切需要能够恢复广泛功能性HBV特异性免疫的治疗性疫苗策略[13] [14]。

大多数HBV治疗性疫苗的设计都集中在增加抗原的广度上。HBsAg仍然是一个核心抗原，因为HBsAg的丢失伴随着抗-HBs血清转化，被认为是功能性治愈的关键终点[15] [16] [17] [18]。然而，仅基于HBsAg的疫苗在恢复有效的细胞免疫力方面表现出有限的能力[19]，尤其是与病毒控制密切相关的HBcAg特异性细胞毒性T细胞反应[20] [21] [22] [23]。因此，已将额外的HBV抗原纳入治疗性疫苗平台中，以扩大T细胞表位覆盖范围并增强抗病毒免疫力[13] [18]。其中，HBcAg特别有吸引力，因为它能形成高度有序的病毒样颗粒（VLPs），这些颗粒能够有效激活B细胞[24]和T细胞[25] [26]，并可以增强对共同递送的HBsAg的免疫反应[27] [28] [29] [30]。

HBx是另一种具有临床意义的HBV抗原，因为它高度保守，支持HBV的复制和持续存在，并促进肝细胞癌的发生[31] [32] [33]。包含HBx的治疗性疫苗平台，包括GS-4774等多抗原方法，已经证明加入HBx、HBsAg和HBcAg可以扩大HBV特异性T细胞反应[34] [35] [36]。然而，大多数多抗原疫苗策略主要将病毒抗原视为独立的T细胞表位来源。HBV抗原之间的物理关联是否可以直接调节抗原的摄取、抗原呈递和免疫极化仍大多未被探索。这是一个重要的空白，因为抗原-抗原关联可能会改变抗原呈递细胞处理和呈递病毒蛋白的方式，从而影响疫苗诱导的免疫质量。

在这项研究中，我们评估了重组小 HBsAg（rHBs）、HBc149-VLPs（rHBc149）和HBxAg（rHBx），单独或成对组合使用，以确定HBV抗原的关联是否可以调节抗原特异性免疫。我们发现rHBx作为rHBc149的非免疫原性免疫调节伴侣发挥作用。在机制上，rHBx与rHBc149-VLP物理结合，增强了抗原呈递细胞对rHBc149的摄取，促进了其向引流淋巴结的转运，并优先增强了HBc特异性抗体和CD4⁺ T细胞的反应。在功能上，用rHBx+rHBc149复合物进行免疫可以在HBV抗原相关的肿瘤模型中增强抗肿瘤免疫。这些发现表明抗原-抗原关联是一种之前未被充分认识的机制，可以影响HBV抗原的呈递，并为使用HBx作为基于HBc的治疗性疫苗设计的模块化伴侣提供了理论依据。

章节片段

DNA构建

为了构建质粒pET26b-Pelb-rHBx（图S1A）和pET22b-rHBc149（图S1B），GenScript（美国皮斯卡特韦）根据乙型肝炎病毒的氨基酸序列，使用大肠杆菌的密码子用法合成了HBxAg和包含前149个氨基酸的截短核心蛋白的DNA序列。HBxAg的合成DNA序列被克隆到质粒pET-26b（+）（Novagen，美国）的< />I和< />I位点上。因此，N端与pelB

重组HBV抗原的制备

为了验证HBV X、S和核心抗原组合对免疫反应的协同效应，重组HBV X抗原（rHBx）（图S1A）和截短的核心蛋白（rHBc149）（图S1B）分别在大肠杆菌中表达，并通过亲和层析纯化。SDS-PAGE和Western blot分析确认了这两种蛋白质的纯度和预期的分子量（图S1C–D）。不含融合蛋白的全长rHBx溶解性较差。

讨论

治疗性疫苗接种是实现慢性HBV感染功能性治愈和预防HBV相关肝细胞癌（HCC）的关键策略。有效的治疗性疫苗有望恢复广泛的HBV特异性免疫力，特别是针对对病毒控制至关重要的HBc特异性反应。虽然已经在治疗性疫苗设计中加入了多种HBV抗原，但病毒抗原之间的相互作用对免疫学的影响仍

结论

总之，本研究确定HBx作为一种通过抗原关联增强HBc导向免疫的免疫调节伴侣。这些发现表明抗原-抗原相互作用是一种之前未被充分探索的调节抗原呈递和免疫反应的机制。这一概念可能为下一代针对慢性病毒感染和病毒相关癌症的治疗性疫苗的合理设计提供框架。

CRediT作者贡献声明

Hung-Chun Liao：撰写 – 原始草案、方法学、形式分析、概念化。Min-Syuan Huang：验证、数据管理。Wan-Ling Wu：可视化、研究。Chen-Yu Hsu：研究。Fang-Feng Chiu：方法学。Li-Rung Huang：验证、资源。Shih-Jen Liu：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取、概念化。

利益冲突声明

无。

致谢

我们感谢NHRI的实验动物中心提供的动物饲养和技术支持。

Hung-Chun Liao|Min-Syuan Huang|Wan-Ling Wu|Chen-Yu Hsu|Fang-Feng Chiu|Li-Rung Huang|Shih-Jen Liu