《International Journal of Biological Macromolecules》：Nanoparticles prepared from different plant protein isolates using alkali-heat synergistic pH-shifting method to stabilize Antarctic krill oil-loaded high internal phase emulsions
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摘要采用碱热（pH 12.0，80°C）协同pH调节技术，从五种植物蛋白分离物中制备了纳米颗粒：大豆蛋白、蚕豆蛋白、绿豆蛋白、豌豆蛋白和马铃薯蛋白。该处理方式使蛋白质 unfolding，部分水解，并促进其自组装成为纳米颗粒。处理后，β-折叠结构含量降低（例如，SPI从46.22
摘要
采用碱热（pH 12.0，80°C）协同pH调节技术，从五种植物蛋白分离物中制备了纳米颗粒：大豆蛋白、蚕豆蛋白、绿豆蛋白、豌豆蛋白和马铃薯蛋白。该处理方式使蛋白质 unfolding，部分水解，并促进其自组装成为纳米颗粒。处理后，β-折叠结构含量降低（例如，SPI从46.22%降至32.85%，平均减少了约12%），α-螺旋和β-转角结构含量增加，从而导致蛋白质 unfold和表面疏水性的显著提升。大多数蛋白质形成了相对较小的纳米颗粒（例如，POINP：9.0 ± 2.5 nm），但豌豆蛋白形成了相对较大的聚集体（18.9 ± 7.0 nm和70.4 ± 7.1 nm）。大豆蛋白和蚕豆蛋白纳米颗粒制备出的AKO负载高内相乳液（HIPEs）最稳定，具有高绝对zeta电位（>30 mV）和低界面张力（<15 mN）。
引言
Euphausia superba（南极磷虾）是一种宝贵的海洋资源，从中提取的南极磷虾油（AKO）是不饱和脂肪酸（特别是EPA和DHA）的良好来源，使其成为功能性食品中潜在的脂质强化成分[1]。与鱼油不同，鱼油中的ω-3脂肪酸以甘油三酯形式存在，而AKO中的ω-3脂肪酸主要以磷脂形式存在，这使得它们更具生物利用性，细胞更容易吸收[2]。此外，AKO中天然含有强效抗氧化剂虾青素，能够协同抑制脂质氧化并稳定其生物活性成分。随着生活水平的提高，人们对身体健康的关注日益增加。与磷脂结合的ω-3脂肪酸也被证明具有更好的生理效应，如更好地调节血脂、减少关节炎症、保护神经系统等[3]。然而，AKO在水中的溶解度低且易氧化，极大地限制了其在食品系统中的实际应用[4]。因此，需要使用适当的乳化剂将其乳化，以便将其添加到食品中。
有效的递送系统对于疏水性营养素和药品的封装至关重要。高内相乳液（HIPEs）是指内相体积分数大于74%的乳液，这种乳液具有独特的半固态特性。由于其独特的功能和结构特性，HIPEs在食品工业中受到广泛关注。它们作为一种脂肪替代品、营养递送系统以及3D打印食品墨水具有很大潜力。此外，HIPEs在食品产品中的应用还需要有效的监测。进一步的研究可能会揭示其在脂质转化方面的巨大潜力。HIPEs的稳定性在很大程度上取决于稳定剂的选择，而稳定机制是重要的研究课题。HIPE稳定剂常与蛋白质纳米颗粒一起使用，因为它们具有高可用性、高生物相容性和良好的界面特性[5]。具体来说，纳米颗粒的大小、表面性质和蛋白质二级结构是影响乳液稳定性的关键因素。研究表明，乳清蛋白和大豆蛋白分离物（SPI）可以用来制备稳定的HIPEs，但不同蛋白质纳米颗粒的稳定行为差异很大，其背后的机制尚不完全清楚。
植物蛋白分离物，包括大豆蛋白分离物（SPI）、蚕豆蛋白分离物（FPI）、绿豆蛋白分离物（MPI）、豌豆蛋白分离物（PPI）和马铃薯蛋白分离物（POI），具有许多优势，如环境可持续性、高可用性、低成本生产和均衡的氨基酸组成[6]。然而，这些蛋白质在其天然状态下的低溶解度限制了它们的广泛应用。因此，通常需要对它们进行结构修饰，以增强其功能特性，如溶解度、乳化能力和凝胶形成能力。
碱性和热处理结合的pH调节可以导致蛋白质 unfold和结构重排，从而促进分子间的交联，并形成具有改善溶解度和乳化性能的蛋白质纳米颗粒[7]。尽管这种方法已经在一些植物蛋白质上进行了研究，但关于其在不同植物蛋白分离物（包括FPI、MPI、PPI和POI）上的应用比较仍很有限。此外，关于使用改性植物蛋白纳米颗粒稳定的AKO负载HIPEs的研究也较少。
在修改策略方面，最近的研究主要采用单独的pH调节，例如通过pH循环制备Pleurotus geesteranus蛋白纳米颗粒来构建W1/O/W2双乳液[8]，或者单独的热处理，例如通过控制加热制备乳铁蛋白纳米颗粒[9]。相比之下，本研究在pH调节的 unfolding阶段同时结合了极端碱性pH（12.0）和高温（80°C），实现了更广泛的蛋白质 unfolds和可控的重组装。在蛋白质选择方面，大多数先前的研究集中在单一蛋白质来源上，如夏威夷果蛋白[10]，或包含一种蛋白质和另一种聚合物的二元系统，例如大豆蛋白分离物与细菌纤维素[11]；跨多种结构多样性的蛋白质进行系统比较的研究仍然很少。在分析范围方面，现有研究通常只关注单一性能指标，例如评估通过热辅助pH调节制备的南瓜籽蛋白分离物纳米颗粒的乳化性能和分散性[12]。相比之下，本研究建立了一个完整的多尺度分析框架，全面关联了分子结构、纳米形态、界面行为、乳液功能和消化吸收。
在这项研究中，考虑了多个方面。首先，使用碱性和热辅助的pH调节处理结合自组装技术制备了五种植物蛋白分离物的纳米颗粒，包括大豆蛋白、蚕豆蛋白、绿豆蛋白、豌豆蛋白和马铃薯蛋白。其次，描述了所得纳米颗粒的形态、粒径和zeta电位。第三，利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和荧光光谱等多光谱方法研究了碱性-热处理引起的三级和二级结构变化。这些研究还用于解释纳米颗粒形成过程和蛋白质溶解度的提高。然后，将这些制备好的纳米颗粒用作AKO负载HIPEs的稳定剂。所得乳液在流变行为、稳定性和氧化稳定性方面进行了系统的评估。此外，还研究了HIPEs的体外消化行为，以确定游离脂肪酸（FFAs）的释放量和虾青素的生物利用率。总体而言，本研究系统地比较了不同植物蛋白质在碱性-热修饰下的结构演变和纳米颗粒形成情况，并阐明了蛋白质结构与HIPE系统中乳化性能之间的联系。研究结果为扩展植物蛋白质的功能利用和开发具有更好稳定性和营养价值的特种乳制品提供了技术和理论指导。
章节片段
材料
大豆蛋白分离物（SPI）购自上海麦克林生化科技有限公司（中国）。蚕豆蛋白分离物FPI的来源是湖北三新生物科技有限公司（中国）。绿豆蛋白分离物（MPI）来自西安长博生物科技有限公司（中国），豌豆蛋白分离物（PPI）也购自上海麦克林生化科技有限公司（中国）。马铃薯蛋白分离物（POI）由西安普瑞斯生物工程有限公司提供。
氨基酸组成
五种植物蛋白分离物的总必需氨基酸（EAA）含量范围为37.39 ± 0.26%至40.15 ± 0.24%（表1）。所有样品均符合FAO/WHO标准，要求EAA比例≥36%[31],[32]。氨基酸组成和分布与蛋白质功能密切相关。Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Ala、Tyr和Cys被归类为疏水性氨基酸。疏水性氨基酸含量较高，占总氨基酸含量的37.90 ± 0.11%至39.40 ± 0.08%
结论
CRediT作者贡献声明
周逸如：方法学设计、实验研究、数据整理、初稿撰写。康广毅：实验研究。尹明明：实验研究。张龙：实验研究。王西昌：监督、资金获取、数据整理、概念构思、修订与编辑。刘媛：监督。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
中国国家重点研发计划（2023YFD2401503）、上海海洋大学和上海市教育委员会——高远食品科学技术学科资助的支持（上海海洋大学）。
周逸如|康广毅|尹明明|张龙|王西昌|刘媛
