《International Journal of Biological Macromolecules》：Annexin A2 deficiency alleviates
Mycoplasma ovipneumoniae induced lung inflammation damage by regulating ROS production
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摘要Mycoplasma ovipneumoniae（MO）经常对羊的肺组织造成严重的氧化损伤。据报道， Annexin A2（ANXA2）蛋白可以作为多种支原体的受体。本研究旨在探讨ANXA2是否可以与MO结合，并阐明其在介导MO感染和致病性中的具体调节作用。通过共免疫沉淀（C
摘要
Mycoplasma ovipneumoniae（MO）经常对羊的肺组织造成严重的氧化损伤。据报道， Annexin A2（ANXA2）蛋白可以作为多种支原体的受体。本研究旨在探讨ANXA2是否可以与MO结合，并阐明其在介导MO感染和致病性中的具体调节作用。通过共免疫沉淀（CO-IP）和GST pull-down实验验证了ANXA2与MO的粘附样糖蛋白LppT之间的相互作用。同时敲低ANXA2的表达水平以观察其对支原体细胞粘附的影响，并评估了ANXA2抑制对细胞自噬、活性氧（ROS）生成、凋亡水平以及细胞增殖的影响。此外，还使用了基因编辑小鼠来评估其对MO感染的炎症反应。最终，运用新型EOCas12i基因编辑系统生成了ANXA2基因编辑的羊。实验结果证实，MO的LppT糖蛋白确实能与ANXA2结合。敲低ANXA2表达并未显著降低支原体对细胞的粘附能力；然而，抑制ANXA2可以恢复细胞自噬，减少ROS生成和凋亡水平，并促进细胞增殖。ANXA2+/?小鼠对MO感染的炎症反应减弱，而ANXA2?/?小鼠的炎症反应并未减轻，这可能是由于ANXA2基因敲除后巨噬细胞M1极化受到抑制，从而影响了支原体的清除。宿主抵抗MO感染需要细胞存活与免疫防御之间的平衡。基于这些发现，我们利用新型EOCas12i基因编辑系统成功培育出了ANXA2基因编辑的羊，为抗病育种提供了新的目标。
引言
支原体（MO）的粘附和侵入是感染过程的关键阶段。MO附着在肺部细胞上，有助于其在宿主体内定植[1]。这种病原体可通过粘附并引发细胞内的各种炎症反应，在羊身上引发一系列临床疾病[2]。最初在Mycoplasma hyopneumoniae中发现P110/LppT家族粘附素N末端结构域（LppT）具有粘附样糖蛋白的功能。LPPT的天然构象能够显著抑制生物素标记的猪气管上皮细胞提取物与完整Mycoplasma hyopneumoniae的粘附[3]。由于MO中也存在LppT蛋白，因此我们推测MO的LppT蛋白也具有粘附功能，可能作为宿主细胞受体的重要配体分子[4]。
宿主ANXA2是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白。最新研究表明，ANXA2可促进细菌或病毒对宿主细胞的粘附、侵入和繁殖[4],[5]。在Mycoplasma hyorhinis中，ANXA2能与p37蛋白的N末端相互作用，进一步激活NF-κB通路促进癌细胞迁移[6]。Mycoplasma bovis的LppA蛋白可以结合并增强ANXA2在细胞膜上的积累，与多种宿主细胞外基质蛋白相互作用，从而促进Mycoplasma bovis对宿主细胞的粘附和扩散[7]。线粒体转录因子A（TFAM）的敲除显著增强了肝癌细胞中的支原体感染，同时伴随着ANXA2表达水平的升高[8]。此外，ANXA2基因敲除的牛肺上皮细胞中IL17信号通路的激活可能有助于细胞对抗支原体感染[9]。因此，我们推测MO可以与ANXA2蛋白结合，这不仅有助于病原体的粘附和侵入，还可能参与细胞的免疫或炎症反应[10]。
目前有大量证据支持ANXA2在促炎和抗炎通路中的双重作用。ANXA2与病毒蛋白相互作用促进感染，同时激活NF-κB通路产生IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症介质，从而增强抗菌反应[4]。在无菌性炎症中，ANXA2通过稳定内皮连接处并修复溶酶体膜来维持血管完整性，限制炎症小体的激活[5]。在Klebsiella pneumoniae等细菌感染中，ANXA2缺乏会加剧炎症并提高死亡率[10]。在肿瘤微环境中，ANXA2通过抑制凋亡、阻碍M1型巨噬细胞的极化以及促进免疫抑制细胞的渗透来促进免疫逃逸[11]。这些发现凸显了ANXA2在调节免疫和炎症中的灵活性。然而，ANXA2在应对MO感染中的具体调节机制尚不清楚，也尚未确定其能否作为培育抗病羊的关键靶基因。尽管如此，感染MO后涉及的ANXA2调控网络和分子通路仍不明确，需要进一步验证ANXA2是否能作为增强羊抗感染能力的关键靶点。
在本研究中，我们预测并验证了MO的LppT蛋白可以与宿主ANXA2蛋白结合并促进其磷酸化。抑制ANXA2后，mTOR通路诱导的细胞自噬被激活，降低了肺纤维细胞在MO刺激后的ROS水平和凋亡，并恢复了细胞增殖。此外，在巨噬细胞中抑制ANXA2通过p65通路减弱了MO诱导的M1型极化，并降低了MO的清除能力。在ANXA2基因编辑的小鼠模型中，ANXA2+/?小鼠表现出明显的MO诱导肺损伤减轻，而ANXA2?/?小鼠的损伤并未完全逆转，反而炎症因子水平升高。基于这些结果，我们利用新型EOCas12i基因编辑系统生成了ANXA2基因编辑的羊，为抗病育种提供了新的目标。
章节片段
生物信息学分析
从NCBI注释或结构域注释中选择标记为“LppT蛋白”和“Mycoplasma_LppT”的氨基酸序列。对不同来源的羊支原体分离株进行多序列比对。基于NCBI提供的LppT（WDV48811.1）和ANXA2（NP_001087257.1）的蛋白质序列，在AlphaFold v2.0中构建了LppT和ANXA2的结构模型[12]。本研究使用了专业的蛋白质和蛋白质DNA/RNA对接程序HDCOK进行对接[13],[14]。
ANXA2是LppT的受体，但抑制ANXA2不会降低支原体的粘附能力
基因组分析显示，LppT在1-980个氨基酸区域内具有高度保守的氨基酸序列，尤其是在1-520aa、550-680aa和730-980aa区域（图1A）。基于此，我们使用AlphaFold2预测了LppT和ANXA2的完整三维结构，并通过HDCOK程序进行对接[2],[3]。
讨论
支原体广泛分布于多种宿主中，可引起动物的多种疾病。研究表明ANXA2能与多种支原体膜蛋白相互作用[6],[8]，其过表达会增强支原体在宿主细胞中的感染[8]。部分研究认为抗ANXA2抗体可以减少支原体对细胞的粘附[6]。然而，在本研究中，siRNA介导的ANXA2敲低并未降低支原体的粘附能力，这可能与...
结论
总之，我们的研究发现，当ANXA2表达水平保持较低时，其在体内具有出色的抗MO能力；但完全敲除ANXA2会加剧支原体对机体的损伤（图7）。此外，我们培育了ANXA2基因编辑的羊以增强其抗MO能力，但由于羊的繁殖周期较长，我们需要利用这些羊扩增更多种群以进行后续的体内研究。
CRediT作者贡献声明
Chenbo Yan：撰写初稿。Tianning Dong：撰写初稿。Hongbing Han：实验研究。Bingjie Li：数据分析。Yongjie Wan：数据分析。Maojun Liu：方法论设计。Yanli Zhang：撰写与编辑。
伦理声明
所有动物实验均获得了南京农业大学机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号：SYXK2022-0031，批准日期：2025-12-1），所有方法和实验均符合相关指南和规定。
资助
农业生物技术育种创新2030重大项目（2022ZD04013）。
致谢
本研究得到了南京农业大学生物信息学中心的高性能计算平台支持。
陈伯渊|董天宁|韩宏兵|李炳杰|万永杰|刘茂军|张彦丽
