《International Journal of Biological Macromolecules》：Proteomic and functional analyses identify an ISG15–TLR3–NF-κB signaling axis associated with the antibacterial response to
Streptococcus agalactiae infection in Nile tilapia
编辑推荐：
•4D-DIA技术揭示了罗非鱼在GBS感染后383个（脾脏）和461个（头部肾脏）差异表达蛋白（DEPs）以及组织特异性免疫反应。•ISG15被确定为关键的调节因子，并在15种脊椎动物中具有保守性。•ISG15通过其UBL与TLR3的LRR/TIR结构域结合；GST Pull-d
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4D-DIA技术揭示了罗非鱼在GBS感染后383个（脾脏）和461个（头部肾脏）差异表达蛋白（DEPs）以及组织特异性免疫反应。
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ISG15被确定为关键的调节因子，并在15种脊椎动物中具有保守性。
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ISG15通过其UBL与TLR3的LRR/TIR结构域结合；GST Pull-down实验发现了927种相关蛋白质。
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ISG15-TLR3复合物招募TRIF和MyD88，从而剂量依赖性地激活NF-κB。
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ISG15-TLR3轴驱动7种细胞因子的产生和IL-10的释放，定义了新的抗菌免疫机制。
引言
无乳链球菌（GBS）仍然是全球尼罗罗非鱼的主要病原体，导致出血性败血症、脑膜脑炎和大规模死亡，给全球罗非鱼产业造成了巨大的经济损失[1]、[2]。近年这一问题愈发紧迫：新的克隆谱系如血清型Ia ST7 CC1已在拉丁美洲和亚洲蔓延，2024-2026年的监测报告显示，养殖分离株对土霉素和恩诺沙星的耐药性逐渐增加[3]、[4]。在中国，2026年的一项流行病学研究进一步揭示了Lactococcus garvieae ST97和S. agalactiae ST7的共存现象，表明病原体谱系正在发生变化，这使得传统的控制策略变得复杂[5]。同时，在埃及和其他地区的患病罗非鱼中分离出了携带tetM、ermB和aac(6′)-aph(2″)多重耐药性的GBS菌株，其中多达35.7%的菌株对七类抗菌药物具有耐药性[6]。这些发展凸显了一个紧迫任务：水产养殖业必须从依赖抗生素的管理方式转向基于宿主免疫的 disease 控制策略，这也是近期罗非鱼养殖可持续性框架中明确倡导的方向[7]。在此背景下，解析罗非鱼对GBS的先天防御机制不仅是基础科学问题，也是开发有效免疫刺激剂、耐药菌株筛选标记物和下一代疫苗的前提——这是国际上活跃的研究领域。
近年来，在研究罗非鱼与GBS之间的相互作用方面取得了显著进展，但仍存在重要知识空白。全基因组关联研究（GWAS）和比较转录组学分析了易感与耐药罗非鱼菌株中的抗性相关位点（如ABCB4、WDR27、THBS2）及差异表达的免疫基因[8]、[9]。最近，对GBS耐药“Zhuangluo 1”菌株的多组学研究将鳃黏液微生物群组成与感染期间的宿主基因表达联系起来[10]，而对GBS致病罗非鱼的血浆蛋白质组学分析表明肌动蛋白细胞骨架和MAPK信号通路在急性反应中起作用[11]。针对表面免疫原蛋白（Sip）和多表位融合抗原的疫苗候选物也进入了实验验证阶段，口服免疫试验中的相对存活率达到了87.5%[12]、[13]。然而，这些研究存在两个局限性，当前的工作正在加以解决。首先，迄今为止大多数关于罗非鱼与GBS相互作用的蛋白质组学研究依赖于传统的无标记或TMT方法，这些方法的深度和定量重复性有限；而四维数据独立获取（4D-DIA）蛋白质组学的优越灵敏度和准确性尚未用于系统地绘制GBS感染期间脾脏和头部肾脏的免疫蛋白质组图谱。其次，尽管转录组学研究已经鉴定出数百个差异表达基因，但调控组织特异性免疫程序的上游调控节点以及这些基因通过何种直接蛋白质-蛋白质相互作用发挥抗菌作用仍大多未知。特别是，至今尚未有研究确定在GBS感染期间将关键免疫调节因子与下游NF-κB介导的炎症反应联系起来的核心信号通路。
干扰素刺激基因15（ISG15）是一种类泛素修饰因子，其功能远超传统的抗病毒作用。在哺乳动物中，ISG15在细菌感染期间具有依赖病原体的作用：它能抵御结核分枝杆菌和白色念珠菌，但也被中间普雷沃氏菌利用来促进疾病发展。在硬骨鱼类中，来自红鼓鱼（Sciaenops ocellatus）、金狮子鱼（Trachinotus ovatus）和中国黑睡鱼（Bostrychus sinensis）的ISG15同源物已被证明能响应细菌刺激并调节炎症细胞因子表达[13]、[14]。最相关的是，Wang等人在2026年的研究中鉴定并表征了罗非鱼中的OnISG15，证明了其在细菌刺激下的上调作用及其在调节抗菌免疫反应中的作用[15]。尽管取得了这些进展，仍存在三个关键空白。(i) ISG15在任何硬骨鱼类物种中发挥抗菌作用的分子靶点和相互作用伙伴仍大多未知；现有研究仅限于表达分析和表型检测。(ii) ISG15是否参与罗非鱼的GBS防御机制，如果参与，又是通过哪种受体和信号通路尚不清楚。(iii>目前尚未有任何报道指出ISG15与Toll样受体3（TLR3）之间的物理相互作用及其引发的TRIF/MyD88招募和NF-κB激活，这是一个全新的机制轴。鉴于TLR3通常被视为病毒核酸传感器，且其在抗菌免疫中的作用，特别是在革兰氏阳性细菌感染中的作用仍存在争议，阐明ISG15–TLR3–NF-κB轴将显著推进我们对先天免疫中生物大分子相互作用的理解，并可为开发基于ISG15的水产养殖免疫调节剂提供依据。
为了解决这些空白，我们采用了4D-DIA定量蛋白质组学技术，在GBS感染后24小时对GIFT罗非鱼的脾脏和头部肾脏蛋白质组进行解析，并通过平行反应监测（PRM）验证了关键差异表达蛋白。随后，我们利用GST Pull-down结合质谱技术筛选ISG15的相互作用蛋白，并通过共免疫沉淀、结构域映射和双荧光素酶报告基因实验确认了ISG15–TLR3相互作用及下游NF-κB的激活。总体框架如图1所示。该研究确定了与硬骨鱼类抗菌反应相关的ISG15–TLR3–NF-κB信号通路，为罗非鱼与GBS相互作用提供了高分辨率的蛋白质组资源，并为开发基于免疫的疾病控制策略提供了潜在的分子靶点。
章节摘要
伦理声明
本研究得到了中山大学生命科学学院动物护理和使用委员会的批准，确保符合动物研究的伦理标准。我们已尽力减少基因改良养殖罗非鱼（GIFT罗非鱼）的痛苦。
细菌菌株和培养条件
S. agalactiae菌株（THN0901）由李安兴教授（中山大学）提供。该菌株在28°C下常规培养于Brain Heart Infusion（BHI）液体培养基中
差异表达蛋白的鉴定与验证
我们通过4D-DIA蛋白质组学技术分析了GBS感染后24小时GIFT罗非鱼（每组n=3条鱼）的脾脏和头部肾脏组织的蛋白质组。脾脏和头部肾脏分别鉴定出8280个和8491个蛋白质。主成分分析（PCA）显示两组之间有明显分离，而组内样本聚集紧密（图S1A），表明GBS感染诱导了显著且可重复的蛋白质组重塑
GBS感染后的蛋白质组学为罗非鱼免疫研究奠定了基础
目前对罗非鱼感染分子反应的了解主要依赖于转录组分析或传统的DIA基于的蛋白质组学[25]、[26]、[27]、[28]。然而，转录组数据仅反映了mRNA水平的变化，无法直接捕捉蛋白质翻译和翻译后调节过程中的变化。传统的DIA方法在处理复杂样本和未知肽时也存在覆盖范围有限和鉴定准确度低的问题
结论
本研究利用4D-DIA定量蛋白质组学技术分析了GBS感染后24小时GIFT罗非鱼脾脏和头部肾脏的蛋白质组。该方法特别适合全面覆盖复杂组织样本，可以弥补转录组学和传统DIA方法的局限性。脾脏和头部肾脏分别鉴定出8280个和8491个蛋白质，其中383个和461个为差异表达蛋白（DEPs）；选定的目标蛋白...
CRediT作者贡献声明
刘阳李：撰写初稿、验证、软件开发、方法学设计、实验实施、数据分析。贾和张：验证、方法学设计、实验实施。白颖：验证、方法学设计、实验实施。潘金敏：验证、数据分析。孙乐斌：验证、方法学设计、实验实施。夏俊红：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金获取、概念构思。
本研究中的所有实验均得到了中山大学生命科学学院动物护理和使用委员会的批准，并按照该委员会制定的规则和指南进行。
资金支持
本项工作得到了国家自然科学基金（编号32674005和32373114）的支持。
correspondant authors声明在本研究中不存在利益冲突。
