银杏叶提取物经BDNF介导改善睡眠剥夺所致行为障碍的研究

《IBRO Neuroscience Reports》：BDNF-Mediated Amelioration of Sleep Disruption–Induced Behavioral Disorders by Ginkgo biloba

　　

摘要 引言：睡眠紊乱与认知衰退（如记忆、学习及感觉整合障碍）至情绪失调（如应激与病理性焦虑）等多种不良结局相关。尽管睡前认知活动可能缓解部分此类效应，但仍需有效的药物干预。银杏叶（Ginkgo biloba）作为一种膳食补充剂，具有支持神经功能的广泛药理作用。本研究探讨如下假说：银杏叶通过促进BDNF依赖的神经可塑性，从而恢复认知与情绪稳态，以对抗睡眠剥夺的有害效应。 方法：将28只雄性Wistar大鼠随机分为四组：睡眠紊乱（SD）后给予银杏叶提取物（250 mg/kg，腹腔注射）组、单纯睡眠紊乱组、单纯提取物组及对照组。银杏叶采自德黑兰植物园，提取物经乙醇渗漉法制备，随后蒸发并复溶。动物接受多平台诱导的睡眠紊乱（MPSD），每日2 h，连续3天。行为学评估包括用于应激/焦虑的旷场实验及连续三天的Barnes迷宫空间学习与记忆测试。采用ELISA法定量海马BDNF水平。 结果：腹腔注射银杏叶提取物可改善睡眠紊乱大鼠的学习能力，使探测日潜伏期由71±11 s（剥夺组）缩短至38±8 s（p<0.001）；单用银杏叶组为15±8 s。旷场实验显示，与其他实验组相比，睡眠紊乱大鼠的运动速度与总移动距离均显著增加（P<0.001）。睡眠紊乱使海马BDNF由544.55±23降至381.19±17 pm/ml（p<0.0001）。银杏叶处理显著阻止了这一下降（557±27 pm/ml；p<0.001），且单独给药时较对照组使BDNF升高20%（653±25 pm/ml）。 结论：睡眠紊乱损害记忆与学习，但未显著影响焦虑。银杏叶提取物（250 mg/kg）处理可改善记忆并减轻焦虑。海马BDNF的变化提示其恢复效应可能由提高因剥夺而降低的BDNF水平所介导。由于所用为伊朗产银杏叶提取物，尚需进一步研究以确定最佳提取方法与植物化学成分，从而增强BDNF水平，进而优化银杏叶来源化合物在睡眠与认知应用中的治疗潜力。

一、研究背景与问题

睡眠对注意、记忆巩固、执行功能、情绪调节及人际互动等广泛的认知、情绪与行为过程至关重要。现代社会中，失眠及其他睡眠障碍的患病率因多种因素而上升。睡眠限制或剥夺已成为现代社会日益突出的重大挑战，尤其在高职业负荷与心理社会应激暴露人群中更为明显。不断积累的证据表明，睡眠剥夺与广泛的不良结局相关，包括不同类型记忆、学习与感觉加工受损，高血压等心血管疾病风险增加，免疫与神经系统功能失调，以及应激水平和病理性焦虑升高。此外，睡眠剥夺破坏氧化应激与抗氧化防御之间的平衡，导致细胞损伤。动物模型实验研究进一步表明，睡眠丧失损害海马依赖性与情绪性记忆，同时增加焦虑样行为。类似研究亦显示，睡眠剥夺损害空间与联想学习记忆，并降低某些生物海马中的脑源性神经营养因子（BDNF）水平。

另一方面，越来越多证据表明，学习后充足的睡眠有助于陈述性记忆的巩固，使新获得的信息在无感觉干扰的情况下得以加工与稳定。相反，部分研究提示，睡前从事学习活动可能有助于缓解日常应激及其对睡眠质量的不良影响。此外，有观点提出睡眠期间神经活动增强支持短时记忆向长时记忆表征的转化。

银杏叶是一种广泛使用的药用植物，也是最常服用的膳食补充剂之一。其标准化提取物具有广谱药理特性，构成其多样治疗应用的基础，包括认知障碍、记忆损害、抑郁、肝肾功能障碍、脑血流异常、缺血性疾病、心肌梗死及外周动脉闭塞性疾病的管理。人体临床研究表明，与对照组相比，银杏叶补充可改善轻度认知障碍（MCI）患者的情景记忆。此外，若干系统评价与临床试验提示，银杏叶提取物可能较安慰剂改善轻至中度阿尔茨海默病患者的认知功能。虽然银杏叶并未被一致证明可增强记忆表现本身，但证据提示其可能有助于减轻主观健忘。然而，若干重要问题仍未解决，包括其确切作用机制、可能影响的学习与记忆具体领域、受影响最显著的脑区、其与睡眠依赖性神经清除过程的潜在交互作用，以及提取物标准化与最佳剂量的影响。

新出现的证据亦表明，银杏叶提取物可能对睡眠质量产生有益作用。然而，其在调节睡眠与记忆巩固相互作用中的作用仍不清楚。据此，本研究旨在通过考察银杏叶提取物对睡眠剥夺所致行为障碍的治疗作用，重点关注其潜在机制及脑源性神经营养因子的参与，以填补上述空白。

二、研究设计与结论

本研究将28只雄性Wistar大鼠随机分为四组：睡眠紊乱后给予银杏叶提取物（250 mg/kg，腹腔注射，行为学测试前15分钟给药）组、单纯睡眠紊乱组、单纯提取物组及对照组（既不予睡眠紊乱亦不予提取物）。所有组均接受为期三天的训练（学习）阶段；在提取物处理组中，每日于每次学习训练前进行腹腔注射。末次训练后48小时评估记忆保持。所有实验操作均在12:00至16:00之间进行，以尽量减少昼夜节律变异。

研究结论为：睡眠紊乱导致记忆与学习受损，但对动物焦虑水平无显著影响；银杏叶提取物（250 mg/kg）处理能够改善动物记忆并减轻焦虑；海马BDNF变化结果提示，银杏叶的恢复效应可能由提高因睡眠紊乱而降低的BDNF水平所介导。由于本研究特异性地使用了伊朗产银杏叶提取物，尚需进一步研究以确定增强BDNF水平的最有效提取方法与植物化学成分，此类研究可能有助于优化银杏叶来源化合物在睡眠改善与认知应用中的治疗潜力。

三、关键技术方法

研究采用多平台诱导睡眠紊乱法（MPSD），以透明有机玻璃水箱内四根圆柱平台（直径6 cm、高15 cm）构建睡眠紊乱模型，每日2 h、连续3天；采用旷场实验（OFT）于50×50×50 cm非反光粗糙表面场地内记录10分钟行为，评估应激/焦虑相关指标；采用Barnes迷宫（圆形平台均布18个直径10 cm孔洞，其一通向逃避箱）评估空间学习与记忆，含1天适应、3天训练（每日5次试验）及末次训练后48 h记忆测试；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量海马BDNF水平。实验动物为雄性Wistar大鼠（250–270 g），来源于伊朗德黑兰Pasteur研究所动物研究中心；银杏叶采自伊朗国家植物园。

四、研究结果

空间学习表现：重复测量分析显示各实验组空间学习表现存在显著差异，睡眠剥夺（SD）组定位目标箱潜伏期显著长于对照组、单纯提取物组及睡眠剥夺+银杏叶（SD+Ginkgo）组；Tukey事后分析证实SD组潜伏期显著高于其他实验组（P<0.001），表明睡眠剥夺后空间学习显著受损。组内分析显示时间效应显著，各实验组潜伏期在三个训练日内逐步缩短（P=0.009），表明训练期间空间学习总体改善；但组别×时间交互作用无统计学意义（P=0.70），表明潜伏期随训练日变化的模式在各组间无显著差异。综上，睡眠紊乱与总体空间学习成绩显著较差相关，而各组均表现出与学习相关的潜伏期总体下降；组别×时间交互作用不显著提示各组训练期间改善速率无显著差异。

探测日记忆：睡眠紊乱使潜伏期由18.75±6 s延长至71±11 s（p<0.0001），银杏叶处理使其降至38±8 s（p<0.001），单用银杏叶组为15±8 s。

旷场实验结果：睡眠紊乱对动物内在焦虑水平影响甚微；相反，单用银杏叶提取物显著增加场地中央区域停留次数（提示焦虑样行为减少），同时较其他实验组减少外周区域停留行为。关于移动距离与速度，睡眠剥夺组速度由对照组5.36±0.8 cm/s增至11.57±57 cm/s、距离由1609±259 cm增至3471.45±277 cm（p<0.001与p<0.0001）。

BDNF变化相关结果：睡眠紊乱使海马BDNF水平降低约30%，由对照组544.55±23 pm/ml降至剥夺组381.19±17 pm/ml（p<0.0001）；连续3天腹腔注射银杏叶提取物（250 μg/kg）显著阻止这一下降（557±27，p<0.001）；单独给予提取物使BDNF较对照组显著升高20%（653±25 pm/ml）。此外，相关分析显示记忆表现与海马BDNF水平呈显著正相关（Pearson r=0.511，P=0.008），为BDNF可能参与银杏叶处理后所观察到的认知效应提供额外支持，并提示记忆表现改善可能与海马BDNF水平升高相关。

五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究给予银杏叶提取物以对抗失眠效应，结果显示该提取物处理显著提高实验动物海马BDNF水平。研究证明，睡眠紊乱所致学习与记忆的显著损害可被银杏叶提取物处理有效改善。睡眠紊乱未明显改变内在焦虑相关行为，睡眠剥夺组动物在旷场实验中停留于外周区域的时间仍多于中央区域，且处理对该参数未产生显著影响。然而，尽管睡眠紊乱未显著影响旷场中央区域停留次数，其显著增加运动速度与总移动距离，可能反映剥夺动物的激越或活动过度增强；银杏叶提取物处理减弱了这些增加，提示激越样行为减少。此外，不断积累的证据表明，睡眠紊乱后观察到的学习、记忆及焦虑相关行为损害可能与BDNF水平降低相关；在此方面，银杏叶提取物处理不仅显著提高睡眠紊乱动物的BDNF水平，亦提高对照组BDNF水平，凸显其潜在神经保护与神经调节特性。

讨论还引用证据指出，标准化EGb 761提取物可提高学习速度、改善任务表现并促进已获得信息的保持；在老龄大鼠中，长期给予该提取物与迷宫行为测试中空间记忆改善相关，并伴随记忆相关脑区（如海马）内神经递质水平（尤其5-羟色胺）的改变。EGb 761处理可导致海马神经发生增加及神经元树突结构改善，这些因素与记忆形成直接相关；该提取物还减少β-淀粉样蛋白（Aβ）蓄积，后者是阿尔茨海默病中导致神经元损伤与记忆损害的物质。部分研究提示银杏的神经保护作用可能通过调节血流实现。

睡眠剥夺对海马BDNF水平具有显著负面影响，海马是学习、记忆与神经可塑性至关重要的脑区。大量研究表明，急性与慢性睡眠剥夺均降低海马BDNF水平。BDNF对突触可塑性、神经发生及认知功能至关重要，其减少导致记忆巩固与学习受损。尽管银杏处理未显著影响训练阶段的学习表现，但在末次训练后48小时进行的记忆测试中，银杏处理的睡眠紊乱大鼠记忆表现显著改善。该发现提示银杏提取物可能有助于睡眠紊乱后记忆的保持或改善，而非直接影响学习获得。值得注意的是，行为学发现与海马BDNF变化一致，银杏处理使睡眠紊乱动物BDNF水平升高，与记忆表现改善平行。这些发现提示银杏提取物对睡眠紊乱所致记忆损害的有益效应可能与BDNF相关神经可塑性有关；然而，由于本研究未建立BDNF变化与记忆改善之间的因果关系，尚需进一步研究阐明潜在机制。

讨论进一步阐述，作为对应激的反应，睡眠剥夺可升高皮质醇水平及IL-6、TNF-α等炎症细胞因子，从而抑制BDNF；此外，睡眠剥夺可引起海马氧化损伤，进一步降低BDNF。另一方面，BDNF分泌遵循昼夜节律模式，睡眠剥夺可破坏该节律。海马BDNF降低的后果包括损害神经发生，减慢海马齿状回新神经元产生，这种减少可因突触可塑性减弱而导致空间与情景记忆缺陷；此外，慢性低BDNF水平与抑郁、焦虑及阿尔茨海默病相关，增加神经精神障碍风险。部分研究提示睡眠恢复后BDNF水平可恢复正常。从根本上说，睡眠剥夺破坏神经元稳态并改变神经递质信号，从而损害神经网络功能并促成随后的行为与认知紊乱。

关于机制，讨论提出银杏叶活性化合物（如萜类与黄酮类）可能通过CREB/TrkB通路刺激BDNF表达，或通过抗氧化效应减少氧化应激以防止海马损伤并保持BDNF；其他研究者认为神经递质调节及乙酰胆碱与多巴胺水平改善在BDNF调节中发挥作用。讨论引用Yong Peng等2024年研究显示，100–200 mg/kg银杏叶给药4周使BDNF水平升高30–50%，且水迷宫测试中认知功能改善；Chenyi Xia等2024年研究在氧化应激模型中显示保护效应，给予银杏叶提取物（150 mg/kg）可阻止铝毒性诱导的海马BDNF降低；在老龄大鼠中，银杏叶提高海马BDNF并防止神经元萎缩；在阿尔茨海默病模型中，EGb 761已被证明可提高BDNF并减少淀粉样斑块。部分人体研究显示血清BDNF升高，但关于海马的直接数据有限；在人体中，120–240 mg/日剂量的银杏叶已产生积极认知效应，但其与海马BDNF的直接联系尚需进一步研究。

研究局限性方面，讨论指出尽管所用方法为诱导睡眠紊乱的成熟技术，但睡眠紊乱程度未通过多导睡眠图客观验证，亦未通过行为学指标独立评估。本研究的局限在于结局评估者未对实验分组设盲；尽管设盲会增强方法学严谨性并减少观察者相关偏倚的潜在影响，但主要行为学结局（尤其Barnes迷宫逃避潜伏期）均通过标准化实验程序客观量化；未来研究应纳入盲法结局评估，以进一步减少潜在偏倚并增强研究结果的有效性与可重复性。另一局限为仅使用雄性Wistar大鼠，故结果不能推广至雌性动物，睡眠紊乱与银杏叶处理在行为与神经生物学效应上的潜在性别差异无法评估；未来研究应纳入两性以确定性别是否影响睡眠紊乱效应及对银杏叶的反应，尤其就认知表现与海马BDNF表达而言。

结论部分译文：本研究结果表明，睡眠紊乱导致记忆与学习受损，但对动物焦虑水平无显著影响。给予250 mg/kg剂量的银杏叶提取物能够改善动物记忆并减轻动物焦虑。海马BDNF变化结果提示，银杏叶的恢复效应可能由提高因睡眠紊乱而降低的BDNF水平所介导。由于本研究特异性地使用了伊朗产银杏叶（Ginkgo biloba）提取物，尚需进一步研究以确定增强BDNF水平的最有效提取方法与植物化学成分。此类研究可能有助于优化银杏叶来源化合物在睡眠改善与认知应用中的治疗潜力。