《Immunobiology》：Engineering Inducible Self-apoptotic K562 Cells for Optimized expansion of T Cells
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K562细胞被工程化为可诱导自凋亡的人工抗原提呈细胞（isaAPCs）。isaAPCs通过Fc蛋白诱导的凋亡，确保饲养细胞受控清除，从而增强安全性。isaAPCs支持稳健的T细胞扩增，且在共培养后实现完全自我消除。isaAPC扩增的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）
K562细胞被工程化为可诱导自凋亡的人工抗原提呈细胞（isaAPCs）。isaAPCs通过Fc蛋白诱导的凋亡，确保饲养细胞受控清除，从而增强安全性。isaAPCs支持稳健的T细胞扩增，且在共培养后实现完全自我消除。isaAPC扩增的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）含有更高比例的细胞毒性T细胞和更少的耗竭细胞。isaAPCs能够高效扩增T细胞和自然杀伤（NK）细胞。
论文解读
一、研究背景与问题
过继性T细胞疗法，包括嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法，是当前癌症免疫治疗的重要方向，其核心环节之一在于体外大规模扩增功能性T细胞。传统的抗CD3/CD28磁珠法虽广泛用于外周血来源T细胞的刺激扩增，但对于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）而言，由于这些细胞经历过抗原刺激，常处于终末分化或耗竭状态，磁珠法难以有效逆转其耗竭状态。此外，磁珠法缺乏生理性的共刺激信号和细胞间接触，且缺少多种支持T细胞生长的关键可溶性因子（如IL-6、IL-15、IL-21），通常仅依赖外源性IL-2，可能导致T细胞终末分化并增加CD8+细胞死亡。
因此，当前研究中T细胞尤其是TILs的高效扩增仍依赖饲养细胞提供必要的共刺激信号。历史上常使用经辐照的同种异体外周血单核细胞（PBMCs）或人工抗原提呈细胞（aAPCs）作为饲养细胞。人红白血病细胞系K562因缺乏人类白细胞抗原（HLA）表达而成为工程化饲养细胞的有前景候选，可经基因修饰表达共刺激配体。然而，K562细胞作为饲养细胞的主要局限在于共培养前必须进行辐照（通常100 Gy）以防止其不受控制的增殖。辐照虽可诱导DNA损伤、阻止增殖，但同时也会损伤细胞组分、降低共刺激配体功能，且不同批次间辐照敏感性存在差异，存在灭活不完全导致饲养细胞过度生长的风险，残留的活饲养细胞对临床应用构成生物安全隐患。化学灭活或基因修饰等替代策略也面临残余毒性或细胞存活控制不完全等挑战。
二、研究内容与结论
针对上述问题，研究人员设计了一种新策略：将K562细胞工程化为无需辐照即可诱导自我凋亡的细胞，从而为T细胞扩增提供更安全、更可控的方法。该策略基于双功能分子的设计——将能够结合特定配体的胞外域与能够启动凋亡级联反应的胞内域融合。研究人员选择CD64（高亲和力Fcγ受体I，FcγRI）作为胞外域，因其能结合抗体或Fc融合蛋白的片段可结晶（Fc）区域；同时选择CD7、CD95（Fas）和CD169作为候选胞内凋亡信号域。通过将CD64胞外域与候选蛋白胞内域融合，构建了6种CD64融合蛋白设计，并在HEK293细胞中验证了瞬时表达。结果显示，表达CD64-CD7（SEQ1）的设计在HEK293细胞上呈现最高的CD64密度，并在K562细胞中进一步验证了该设计的稳定表达。研究人员最终选用CD64-CD7（SEQ1）进行可诱导自凋亡人工抗原提呈细胞（isaAPCs）的工程化。
三、主要关键技术方法
研究人员采用慢病毒载体系统将CD137L（4-1BBL）和CD64-CD7融合蛋白转入K562细胞，经嘌呤霉素和杀稻瘟菌素筛选获得稳定表达isaAPCs。凋亡检测采用Annexin-V-FITC和7-AAD双染流式细胞术。T细胞扩增实验使用CD3磁珠从PBMCs中分选T细胞，与isaAPCs以2:1比例共培养14天。TILs扩增实验使用了3例宫颈肿瘤样本和1例肺肿瘤样本（经浙江省肿瘤医院伦理委员会批准，批号IRB-2022-687），比较了CD3/CD28/CD137磁珠、辐照PBMC饲养细胞和isaAPCs三种扩增方法。NK细胞扩增实验使用CD56磁珠从PBMCs中纯化NK细胞。功能评估包括PMA/离子霉素刺激后胞内细胞因子和CD107a染色、流式细胞术杀伤实验及IFN-γ ELISA检测。
四、研究结果
3.1 不同CD64融合配体在HEK293和K562细胞中的表达验证：通过流式细胞术检测CD64胞外区染色，证实CD64-CD7（SEQ1）设计在HEK293细胞中呈现最高CD64密度，在K562细胞中同样显示更强的CD64胞外区染色信号，表明该设计具有稳健的表达和正确的蛋白折叠。
3.2 稳定表达CD64-CD7融合配体和CD137L的K562-based isaAPCs的建立：经慢病毒转导和14天嘌呤霉素筛选后，流式细胞术确认isaAPCs中CD64-CD7和CD137L共表达率达98.40%。与Fc融合细胞因子（IL-15-Fc、IL-21-Fc）孵育实验证实isaAPCs能有效结合Fc融合细胞因子，而野生型K562细胞结合能力极低。
3.3 Fc融合蛋白增加isaAPCs的凋亡：IL-15-Fc/IL-21-Fc处理24小时后，isaAPCs的晚期凋亡率（Annexin-V+7-AAD+）显著增加至22%，而野生型K562细胞、表达野生型CD137L和CD64的K562细胞及未处理isaAPCs的凋亡率均低于10%。与PBMCs共培养进一步加速了isaAPCs的死亡，96小时凋亡率达74.82%，显著高于对照组。
3.4 无需辐照的isaAPCs支持高效T细胞扩增：非辐照isaAPCs与T细胞以2:1比例共培养14天，实现346.4倍扩增，虽低于辐照对照（586.7倍），但与表达野生型CD64/CD137L的K562细胞相当（338.5倍）。流式细胞术证实非辐照组中GFP标记的isaAPCs在第14天被完全清除，而表达野生型CD64的非辐照K562细胞仍残留6.7%。
3.5 isaAPCs优化的TIL扩增：来自3例宫颈肿瘤样本的TILs经isaAPCs扩增后，扩增倍数与PBMC扩增组相当，但显著优于磁珠扩增组。isaAPC扩增的TILs维持了显著更高的CD8+T细胞比例，且富集了PD1?TIM3?低耗竭表型亚群，比例显著高于PBMC扩增组。磁珠扩增法在三组中表现最差。
3.6 isaAPC扩增的TILs表现出增强的效应功能和相当的肿瘤特异性细胞毒性：isaAPC扩增的TILs在再刺激后产生IFN-γ和表达脱颗粒标志物CD107a的细胞比例更高，TNF-α产生亚群也呈现相似趋势。与SiHa宫颈癌细胞共培养时，isaAPC扩增的TILs表现出与PBMC扩增组相当的细胞毒性活性和IFN-γ分泌。最终TIL产品中残留isaAPCs基本检测不到。
3.7 来自肺肿瘤样本的isaAPC扩增TILs：肺肿瘤来源的TILs与isaAPCs以5:1比例共培养14天后实现稳健扩增，最终活力超过90%，优于PBMC扩增组（60–70%）。第14天时CD8+T细胞占57%（PBMC组为30%），94%的CD3+T细胞呈低耗竭表型（PBMC组为65%）。
3.8 isaAPCs应用于NK细胞扩增：isaAPC扩增培养物中CD3?CD56+NK细胞比例显著高于PBMC扩增组，CD3+CD56+NKT细胞比例也更高。经CD56磁珠纯化的NK细胞在isaAPCs初次（2:1）和二次（5:1）刺激下扩增15,814倍。功能上，isaAPC扩增的NK细胞在PMA/离子omycin再刺激后表达CD107a的比例显著高于PBMC扩增对照组。
五、讨论与结论
本研究的核心创新在于将CD64胞外域与CD7胞内凋亡域融合，使饲养细胞能够通过Fc融合蛋白（如IL-15-Fc、IL-21-Fc和人源化CD3抗体）的结合而触发凋亡，从而消除辐照需求。研究证实该系统能有效增加isaAPCs凋亡，同时维持稳健的T细胞扩增，共培养14天后isaAPCs被完全清除，确保最终T细胞产品中无残留饲养细胞。与传统需要外源药物或复杂基因回路诱导凋亡的系统不同，isaAPCs通过常规细胞因子补充即可实现饲养细胞清除。该平台还可通过表达其他共刺激分子（如CD70、CD80、OX40L、CD86）进一步优化，并可拓展至多种细胞毒性淋巴细胞的扩增。
研究也存在若干局限性：肿瘤标本数量有限（3例宫颈肿瘤和1例肺肿瘤）；缺乏体内验证；功能分析主要为短期评估；isaAPC扩增的TILs在肿瘤特异性细胞毒性和IFN-γ分泌方面仅与PBMC扩增组相当而非更优；CD64-CD7/Fc蛋白诱导凋亡与T细胞耗竭减少之间的机制联系有待深入研究。未来需更大样本量、严格匹配的实验条件、长期功能评估及适当的体内效力和安全性模型来进一步验证该平台的临床适用性。
