《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：Vapors of juvenile hormone accelerate progression through the pupal stage and block adult development
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保幼激素（JH）在决定昆虫发育时序与阶段转换性质中具有关键作用。在完全变态昆虫的末龄幼期（即蛹期），JH信号的天然缺失是成虫形态发生所必需的。对早期蛹局部施用外源JH或JH类似物（JHMs）可阻断变态完成与成虫羽化。蛹期发育是幼虫组织被组解或转化为成虫结构的关
保幼激素（JH）在决定昆虫发育时序与阶段转换性质中具有关键作用。在完全变态昆虫的末龄幼期（即蛹期），JH信号的天然缺失是成虫形态发生所必需的。对早期蛹局部施用外源JH或JH类似物（JHMs）可阻断变态完成与成虫羽化。蛹期发育是幼虫组织被组解或转化为成虫结构的关键阶段，涉及JH与蜕皮类固醇（ecdysteroids）的复杂内分泌调控网络。基于对赤拟谷盗（Tribolium castaneum）与意大利蜜蜂（Apis mellifera）蛹局部施用JHMs干扰变态并影响蜕皮类固醇信号、诱导提前角质层鞣化的既有报道，研究人员考察了外源天然保幼激素III（JH III）对上述两种完全变态昆虫蛹的影响。研究人员采用高分辨率延时成像监测整个蛹期形态学特征出现的时间，并在常规角质层表面局部处理之外，证明挥发性JH III可经由已确立的分子信号通路影响蛹发育，从而在实验上证实了JH蒸气可在一定距离外发挥特异性作用的旧有观点。两种JH III施用方式均干扰成虫发育，并加速两个物种蛹期发育标志的出现。总体而言，上述发现拓展了对JH影响变态的理解，阐明了挥发性JH效应的机制，并提出了JH经空气途径发挥作用在昆虫发育中潜在意义的疑问。
研究背景与问题 昆虫胚后发育受内分泌信号调控，保幼激素（JH）在决定发育时序与阶段转换性质中起关键作用。在经历四个以上幼虫龄期的半变态与完全变态物种中，JH信号是阻止晚期幼虫早熟变态的关键因素；在末龄幼期（完全变态的蛹或半变态的末龄幼虫），JH的天然缺失是成虫形态发生所必需。将外源JH或JH类似物（JHMs）施用于包括赤拟谷盗（Tribolium castaneum）在内的早期昆虫蛹，可阻断变态完成与成虫羽化。蛹期是幼虫组织被组解或转化为成虫结构的关键阶段，JH与蜕皮类固醇共同决定蛹期起始与持续时间，并协调神经系统重塑、附肢形成、角质层沉积与鞣化及最终羽化。已有研究显示，对蛹局部施用JHMs干扰变态，同时影响蜕皮类固醇信号并诱导提前的角质层鞣化。上述工作促使研究人员考察外源天然保幼激素III（JH III）对赤拟谷盗与意大利蜜蜂（Apis mellifera）蛹的影响。研究内容与结论 研究人员利用高分辨率延时成像监测蛹期形态学特征出现的时间，除常规角质层表面局部处理外，还证明挥发性JH III经由已确立的分子信号通路影响蛹发育，在实验上证实了JH蒸气可在一定距离外发挥特异性作用的旧有观点。两种施用方式均干扰成虫发育，并加速两个物种蛹期发育标志的出现。意义 该研究拓展了对JH影响变态的理解，阐明了挥发性JH效应的机制，并提出了JH经空气途径发挥作用在昆虫发育中潜在意义的疑问。
关键技术方法 研究以赤拟谷盗（32°C、约70%相对湿度饲养）与来自捷克布尔诺孟德尔大学蜂场的意大利蜜蜂（35°C、70%相对湿度）新蜕皮蛹为材料，采用定制3D打印聚苯乙烯多孔板配合玻璃盖实现局部处理与无接触蒸气暴露，并以单次给药与四次分次给药两种时序方案处理；用定制自动化延时成像系统按不同间隔拍摄蛹发育过程，以形态学标志的出现时间进行时间分辨分析，并用参数逻辑斯谛生存模型（PLSM）处理区间删失数据进行统计；通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测JH调控基因转录水平；通过高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）测定蜕皮类固醇滴度。
研究结果 3.1 局部施用JH加速蛹期进程 对蜕皮后0–8 h的两种蛹局部施用JH III，以延时成像监测形态学标志序列出现。赤拟谷盗中，高剂量（每蛹0.5 μg）使特征进程提前17–24%，低剂量（每蛹0.05 μg）提前6–10%。蜜蜂中，低剂量（每蛹1 μg）压缩时序7–17%，高剂量（每蛹10 μg）缩短蛹期10–40%，羽化受影响最强（分别提前17%与40%），紫色眼色素沉着受影响最小。两种物种中单次给药与四次分次给药之间无显著差异，提示蛹在蜕皮后早期对外源JH最敏感。此外，JH破坏了个体间发育同步性。3.2 JH III蒸气与局部施用效果相当 将JH III滴加于玻璃盖底面而非虫体，蒸气暴露结果与局部处理高度相似：赤拟谷盗高剂量提前22–28%、低剂量提前7–10%，并增加发育不同步；蜜蜂两剂量分别使特征出现时间缩短6–38%与7–39%，但蒸气暴露未改变蜜蜂的发育同步性；两物种中单次与分次给药亦无显著差异。3.3 外源JH导致赤拟谷盗蛹-成虫中间体与第二蛹 局部或蒸气处理的多数蛹出现变态缺陷表型，包括成虫羽化缺陷、蛹表皮斑块及蛴螬陷（gin traps）与尾突（urogomphi）等蛹特征的保留，全羽化成虫附肢远端分节不完善；蛹-成虫中间体与第二蛹为最严重表型，其表现度与发生率随JH III剂量增加，仅高剂量导致蛹期重演。3.4 JH蒸气改变赤拟谷盗蛹的发育基因表达 局部处理使JH诱导基因Krüppel-homolog 1（Kr-h1）与Broad-Complex（Br-C）mRNA升高，高剂量、处理后48 h更明显；成虫决定基因ecdysone-induced protein 93F（E93）在局部处理后未见显著变化。JH III蒸气在24 h与48 h均诱导Kr-h1与Br-C转录，48 h时高剂量蒸气使E93 mRNA显著下降；蒸气在诱导Kr-h1上似更有效。结果表明无论经角质层接触还是经蒸气暴露，外源JH均通过同一分子机制扰乱蛹发育。3.5 外源JH降低赤拟谷盗蛹的20E水平 HPLC-MS/MS显示，局部施用0.5 μg JH III后24、48、72 h，活性类固醇激素20-羟基蜕皮酮（20E）水平受抑制，相对对照的降低幅度由约1.8倍增至约2.3倍、约9倍；前体蜕皮酮（E）仅在24 h显著下降（约1.9倍），2-脱氧蜕皮酮（2dE）呈相反趋势并在后两个时间点显著升高。20E的持续下降表明加速发育并非源于20E信号增强，而与其下降及两个20E应答基因（E75、HR3）表达降低相关。
讨论与结论 讨论指出，蛹期JH信号的时序性缺失为成虫分化所必需，早期蛹对不合时宜的JH活性尤为敏感，导致变态基因失调、发育停滞并形成第二蛹或蛹-成虫中间体。低剂量下即使羽化时间明显缩短，仍可羽化出形态正常成虫，说明蛹期时长具有相当灵活性，加速本身未必导致变态失败；高剂量则阻断羽化，造成蛹期致死。赤拟谷盗的发育缺陷伴随变态基因网络失调：JH诱导的变态抑制因子Kr-h1与蛹指定因子Br-C上调，而成虫决定因子E93在处理两天后轻度受抑，与成虫发育受损及蛹程序重演相关。研究人员认为，外源JH通过改变变态基因表达扰乱变态所需形态发生事件的时序，同步性丧失导致组织间缺乏协调，形成兼具幼期与成虫身份的异时状态。研究还将蛹期加速与无翅类及半变态昆虫胚胎中外源JH或JHM导致提前组织分化与提前形成后期角质层类型的现象相联系，指出JH兼具形态静止与分化作用。20E滴度降低与JHMs处理蛹中E75、HR3表达下降一致，也与蜜蜂中的报道相符；虽不能建立蜕皮类固醇信号改变与表型间的因果联系，研究人员提出鞣化等形态学特征的提前出现反映了内分泌失调所致的异时性偏移。关于远距离作用，蒸气施用与局部处理同等有效，表明JH III挥发性足以使蒸气引发发育反应；气态JH III须经室内空气扩散、经气门或穿透蛹角质层进入血淋巴与组织、跨细胞膜并最终结合胞内受体MET。相关研究已显示空气传播的JH III、其前体甲基法尼酯及脂肪族JHMs可在细胞报告分析中激活JH受体。这些发现提示，在密闭环境中局部施用可能无意中造成混合暴露途径，建议实验中使用不挥发的JHMs如fenoxycarb；JH/JHMs的挥发性在实验之外亦有意义：气态扩散可能影响蜂巢内或工业规模化饲养条件下密集种群昆虫的发育，而无接触效应在害虫防治中可能有益，气态methoprene已显示可改变入侵阿根廷蚁的表皮碳氢化合物组成，JHM蒸气亦可诱导白蚁兵蚁发育，在JH参与品级分化的真社会性昆虫中，挥发性天然激素是否作为空气传播的内分泌信号发挥生物学作用值得推测。研究结论为：JH蒸气具有与局部处理等效的作用；气相JH诱导经典JH受体靶基因表达；外源JH加速蛹发育同时阻止成虫形态发生；JH处理蛹中类固醇激素（20E）滴度下降；气相JH在实验与生物学情境中可能具有重要意义。
