反式乌头酸（trans-aconitic acid，tAA，CAS: 4023-65-8）为C6不饱和三羧酸，因兼具活性羟基与α,β-不饱和双键，被美国能源部列为高价值生物基平台化合物，可用于食品添加、生物农药及替代邻苯类增塑剂。传统甘蔗提取与柠檬酸化学脱水法浓度低、纯化繁复，天然微生物产量不足0.1 g L?1，工程大肠杆菌与土曲霉体系仍存在产率与产量瓶颈。研究人员以工业柠檬酸生产菌黑曲霉（Aspergillus niger）为底盘，系统解析tAA合成中生物合成、线粒体转运与跨膜外排的协同关系：异源表达去除线粒体信号肽的顺乌头酸酶AtAcoA与突变型2-甲基柠檬酸脱水酶PrpD??促进柠檬酸向顺乌头酸（cis-aconitic acid，cAA）转化；引入顺乌头酸异构酶Adi1加速cAA向tAA转化；装配土曲霉线粒体转运蛋白MttA将线粒体内cAA外排至胞质；利用跨膜外排蛋白AexA实现tAA胞外分泌。最终构建工程菌MEFC 1826（OE AtacoA/prpD??/adi1/mttA/aexA），在50 L补料分批发酵中实现tAA滴度109.27 g L?1、对葡萄糖得率0.66 g g?1、产率0.984 g L?1 h?1，为迄今最高微生物合成水平，证明黑曲霉底盘在生物基化学品制造中的工业潜力。
研究背景与立项逻辑
反式乌头酸（trans-aconitic acid，tAA）是一种含三个羧基与不饱和双键的C6三羧酸，因结构可调性被美国能源部列入高价值生物基平台化学品。其下游应用覆盖食品添加、线虫生物农药及替代有毒邻苯增塑剂，但传统植物提取与柠檬酸化学脱水路线浓度低、纯化重，天然微生物产量长期低于0.1 g L?1，工程细菌与土曲霉体系仍受限于产率与产量。黑曲霉（Aspergillus niger）作为GRAS（一般认为安全）工业真菌，天然具备极强低pH耐酸能力、成熟柠檬酸高产背景与高效碳流通道，且缺失衣康酸合成路径，是构建tAA细胞工厂的理想底盘。研究人员首次以工业柠檬酸黑曲霉MEFC 1501为出发菌，系统重编程其生物合成、线粒体转运与跨膜外排模块，论文发表于《Green Carbon》。
引入Adi1与TbrA后，tAA滴度由背景水平跃升至40 g L?1以上，其中真菌源Adi1与P_glaA组合最优，摇瓶达43.76 g L?1。说明cAA热力学自发异构过慢，异构酶是首要瓶颈；叠加PrpD??后进一步升至46.7 g L?1，提示前体供给在异构解除后成为新限制。
3.3 异源表达MttA提升胞质cAA可及性
线粒体cAA需被导出以避免重新进入TCA循环。表达MttA单独使tAA提升至15.97 g L?1；与AtAcoA/PrpD??/Adi1组合后摇瓶达59.2 g L?1，证明跨区室转运是释放通量的关键节点。
3.4 通过特异外排系统强化tAA胞外分泌
AexA定位于质膜，单独表达使野生背景tAA提升11.5倍；在已强化前体供应的MEFC 1826中叠加AexA，摇瓶达65.0 g L?1。表明外排收益高度依赖上游通量，模块需协同而非孤立堆叠。
3.5 50 L生物反应器放大
两级种子与发酵工艺中，分批发酵77 h得tAA 78.2 g L?1、得率0.60 g g?1；补料分批111 h达109.27 g L?1、得率0.66 g g?1、产率0.984 g L?1 h?1，PMV稳定约13%，残cAA可在下游热处理转为tAA，主要残留挑战为约10 g L?1柠檬酸。
讨论与结论翻译
讨论指出tAA途径不是线性模块叠加，而是TCA通量、线粒体外排与胞外分泌耦合的网络；限速点随改造阶段动态迁移。结论部分译写如下：研究人员成功将工业黑曲霉工程化为高效tAA细胞工厂。系统解析表明，Adi1介导的异构化是原初瓶颈，但峰值性能必须依赖线粒体cAA外排、胞质前体扩容与AexA外排协同。最优菌株在50 L补料分批中创下109.27 g L?1纪录，超越既有土曲霉体系，依托黑曲霉耐酸性与GRAS属性，为tAA商业制造提供可行绿色路线；未来应消减残柠檬酸并继续工艺与菌株迭代，以逼近工业柠檬酸基准。
