《Food Chemistry: Molecular Sciences》：Multi-omics analysis reveals multilayer regulation of carotenoid accumulation underlying watermelon flesh color variation
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多组学分析揭示了西瓜果肉颜色变异背后类胡萝卜素积累的多层次调控。研究比较了三种具有不同果肉颜色的西瓜品系，鉴定出各自不同的类胡萝卜素谱。番茄红素/β-胡萝卜素比值与果肉颜色变异相关。ClLCYB等位变异在异源验证体系中改变了β-胡萝卜素的积累。ClLCYB序列
多组学分析揭示了西瓜果肉颜色变异背后类胡萝卜素积累的多层次调控。研究比较了三种具有不同果肉颜色的西瓜品系，鉴定出各自不同的类胡萝卜素谱。番茄红素/β-胡萝卜素比值与果肉颜色变异相关。ClLCYB等位变异在异源验证体系中改变了β-胡萝卜素的积累。ClLCYB序列变异与类胡萝卜素组成差异相关。西瓜（Citrullus lanatus L.）是葫芦科中栽培和消费最广泛的园艺作物之一。作为重要的夏季水果，西瓜富含水分和糖类，是生物活性植物化学物质的有价值膳食来源。果肉颜色是关键品质性状，也是感官属性、消费者偏好和市场价格的关键决定因素。重要的是，它反映了内部次级代谢物，特别是类胡萝卜素的组成和积累。西瓜果肉表现出广泛的颜色表型谱，包括白色、黄色、橙色和红色。类胡萝卜素积累是西瓜色素沉着的首要生化决定因素。阐明果肉颜色变异的分子基础对于理解植物类胡萝卜素代谢具有重要意义，并可能有助于开发具有目标类胡萝卜素谱和果肉颜色性状的西瓜品种。分子生物学和组学技术的进展已促成多个植物物种中类胡萝卜素生物合成关键结构基因的鉴定和功能表征，包括八氢番茄红素合酶（PSY）、八氢番茄红素脱饱和酶（PDS）、ζ-胡萝卜素脱饱和酶（ZDS）、类胡萝卜素异构酶（CRTISO）和番茄红素β-环化酶（LCYB）。果实着色通常与色素生物合成、修饰、储存和周转过程的协同调控相关，这些过程共同塑造色素积累模式。在西瓜中，ClLCYB（番茄红素β-环化酶）已被鉴定为红肉与非红肉表型分化的主要基因。尽管ClLCYB是控制番茄红素向β-胡萝卜素转化的关键酶，但ClLCYB的自然等位变异是否导致西瓜果肉颜色类型之间类胡萝卜素组成的差异，以及这种变异是否在异源体系中影响ClLCYB功能，尚不清楚。除单个基因分析外，近期的转录组和代谢组研究已揭示果肉颜色变异伴随类胡萝卜素生物合成基因表达和代谢物组成的协同变化，为色素积累的分子基础提供了有价值的见解。例如，红肉和黄肉西瓜品种的比较转录组和代谢组分析揭示了类胡萝卜素生物合成途径中协同的表达变化，并建立了与番茄红素和β-胡萝卜素积累相关的关键基因-代谢物关联。这些两层多组学研究为理解果肉色素沉着的转录调控奠定了基本框架，并为后续研究缩小了核心候选基因范围。然而，以往的多组学研究集中于转录组和代谢组，缺乏蛋白质组分析来弥合这些水平之间的差距。蛋白质丰度水平的变化以及转录本、蛋白质和代谢物改变之间的一致性仍未得到充分探索。因此，尽管以往的转录组和代谢组分析已鉴定出许多与西瓜色素沉着相关的候选基因和代谢物，但与西瓜品系间类胡萝卜素组成和积累差异相关的分子特征仍不完全清楚。由于转录本丰度本身并不完全反映蛋白质丰度或代谢结果，蛋白质组分析可提供与类胡萝卜素组成和积累相关的蛋白质丰度模式的补充信息。特别是，越来越多的证据表明，由于翻译效率、蛋白质稳定性和降解动力学的差异，mRNA丰度并不总是与蛋白质丰度相关。蛋白质组分析提供蛋白质丰度模式的补充信息，有助于鉴定与类胡萝卜素组成和积累相关的分子变化。除对西瓜品系间分子特征的表征有限外，以往研究主要依赖二元比较，如红肉与白肉或黄肉的比较。涉及多个具有不同果肉颜色表型的西瓜品系的比较分析相对有限。比较此类品系有助于表征类胡萝卜素组成和积累的差异，并鉴定相关的分子特征。此外，尽管Citrullus lanatus番茄红素β-环化酶（ClLCYB）已被鉴定为与果肉颜色形成相关的重要候选基因，但在三个西瓜品系中鉴定的ClLCYB等位基因对β-胡萝卜素积累的影响仍知之甚少。为填补这一空白，研究人员研究了这些等位变异与类胡萝卜素积累模式之间的相关性，并通过异源表达系统进一步评估了其功能作用。为填补这些空白，研究人员采用结合转录组学、蛋白质组学和靶向代谢组学的多组学分析方法，比较了三种表现出不同果肉颜色的西瓜品系：L600（红肉）、宣彩4（XC4，橙肉）和宣彩6（XC6，黄肉）。具体而言，研究人员旨在：（1）表征三个品系间类胡萝卜素组成和积累的差异；（2）鉴定与类胡萝卜素相关性状相关的基因共表达模块；（3）表征与三个品系相关的蛋白质丰度差异；（4）在异源表达系统中比较两种天然存在的ClLCYB等位基因对全细胞β-胡萝卜素积累的影响。研究结果为进一步研究与这些品系果肉颜色差异相关的候选分子特征提供了基础。
研究背景：西瓜（Citrullus lanatus L.）是葫芦科重要园艺作物，果肉颜色是决定感官品质、消费者偏好与市场价格的关键性状，其生化基础主要在于类胡萝卜素的组成与积累。西瓜果肉存在白、黄、橙、红等多种颜色表型。以往研究已鉴定八氢番茄红素合酶（PSY）、八氢番茄红素脱饱和酶（PDS）、ζ-胡萝卜素脱饱和酶（ZDS）、类胡萝卜素异构酶（CRTISO）和番茄红素β-环化酶（LCYB）等关键结构基因，并确认ClLCYB是红肉与非红肉表型分化的主要基因。然而现有研究存在三方面不足：其一，以往多组学工作集中于转录组与代谢组，缺乏蛋白质组层面数据，难以弥合转录本与代谢物之间的差距，转录本丰度并不总能反映蛋白质丰度与代谢结果；其二，以往研究多采用红肉与白肉或黄肉的二元比较，涉及多个不同果肉颜色品系的多重比较相对有限；其三，ClLCYB虽为重要候选基因，但不同品系中天然等位变异对β-胡萝卜素积累的影响尚不清楚。基于此，研究人员开展本研究，旨在表征三个品系类胡萝卜素组成与积累差异、鉴定与类胡萝卜素性状相关的基因共表达模块、表征蛋白质丰度差异，并在异源体系中比较两种天然ClLCYB等位基因对全细胞β-胡萝卜素积累的影响。
关键技术方法：研究人员以L600（红肉）、宣彩4（XC4，橙肉）、宣彩6（XC6，黄肉）三个品系为材料，均种植于北京延庆区，于授粉后35天（DAP）取样，每品系随机选取6株、每株取1果，取赤道部果肉并排除种子与近果皮组织。主要技术包括：靶向代谢组学（UHPLC–MS/MS，超高效液相色谱-串联质谱）定量类胡萝卜素；转录组测序（RNA-seq）及差异表达基因（DEG）分析；基于数据独立采集（DIA）的定量蛋白质组学及差异表达蛋白（DEP）分析；加权基因共表达网络分析（WGCNA）；以及在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)中构建双质粒异源表达体系，结合高效液相色谱（HPLC）测定β-胡萝卜素含量。
研究结果：
3.1 果肉表型与类胡萝卜素代谢谱：通过色差仪测定与靶向代谢组学分析发现，L600果肉深红（a为19.00±2.23），XC6浅黄（b为30.78±7.87），XC4橙色居中。L600番茄红素含量达118.38±56.83 μg/g FW，分别约为XC4和XC6的30倍和204倍；XC6番茄红素仅0.58±0.26 μg/g FW，而 Violaxanthin、β-Cryptoxanthin、Lutein等下游叶黄素类及其酯化衍生物积累增加；XC4呈中间型。番茄红素/β-胡萝卜素比值在L600约60、XC4约3.6、XC6约0.83，表明番茄红素与β-胡萝卜素的平衡是果肉颜色变异的关键决定因素。
3.2 全局转录组比较与表达模式分析：通过RNA-seq鉴定17,896个高质量表达基因，主成分分析（PCA）显示三品系清晰分离，XC4更接近L600。L600与XC6间鉴定948个DEG，XC6与XC4间940个，L600与XC4间仅461个。层次聚类得到10个亚簇，KEGG富集显示L600高表达亚簇富集于淀粉蔗糖代谢、类固醇生物合成等途径，XC6富集于类胡萝卜素生物合成、光合作用与内质网蛋白加工，XC4富集于萜类骨架生物合成与植物-病原互作。
3.3 WGCNA鉴定与类胡萝卜素代谢分配模式相关的共表达模块：以β=9构建网络获得17个模块。Green-yellow模块与八氢番茄红素（r=0.81）、phytofluene（r=0.80）、γ-胡萝卜素（r=0.70）和番茄红素（r=0.76）正相关，并与L600关联；Magenta模块与Violaxanthin（r=0.78）、Neoxanthin（r=0.61）及多种叶黄素酯正相关，并与XC6关联；XC4对两模块均呈中等关联，提示橙色表型为中间类胡萝卜素积累谱。
3.4 定量蛋白质组学揭示与果肉颜色变异相关的蛋白水平调控：通过DIA蛋白质组学在XC4 vs L600、XC6 vs L600、XC4 vs XC6中分别鉴定1518、1307、1277个DEP。KEGG与GO富集显示DEP除富集于类胡萝卜素生物合成、萜类醌代谢外，还富集于碳水化合物代谢、光合作用及细胞壁生物合成与重塑。蛋白互作（PPI）网络结合聚类显示三品系蛋白表达模式明显不同。L600中CRTISO等上游蛋白丰度较高，NCED丰度升高；XC6中VDE等下游叶黄素代谢蛋白丰度较高；XC4呈中间水平。值得注意的是，ClLCYB蛋白丰度在三品系间无显著差异。
3.5 ClLCYB等位变异通过差异β-胡萝卜素积累能力促成颜色分化：序列比较显示，与XC6（LCYB/LCYB）相比，L600（lcyb/lcyb）含3个单核苷酸多态性（SNP），其中2个非同义突变导致p.Phe226Val和p.Asn435Lys氨基酸替换；XC4为杂合（LCYB/lcyb）。蛋白三级结构建模显示突变体整体构象偏移（RMSD=0.152），活性口袋体积由5383 ?3降至1620 ?3。异源表达验证显示，携带野生型ClLCYB的菌株β-胡萝卜素产量为1.11×10?4 pg/cell，突变体Cllcyb仅4.16×10?5 pg/cell，显著降低。据此推断L600的Cllcyb等位基因不利于番茄红素转化而促进红肉，XC6野生型等位基因促进向黄色素转化，XC4杂合状态对应中间表型。
3.6 西瓜果肉颜色形成的分子模型：综合多组学与功能验证结果，研究人员提出果肉颜色并非由单一代谢步骤决定，而是上游代谢供应、ClLCYB相关类胡萝卜素积累模式与下游类胡萝卜素转化协同调控的结果。L600中上游中间体丰富、CRTISO水平升高，加之Cllcyb等位基因降低β-胡萝卜素积累，共同支持番茄红素积累；XC4为杂合，ClLCYB功能容量居中，番茄红素与下游类胡萝卜素共存；XC6中野生型等位基因促进β-胡萝卜素积累及下游叶黄素类富集。
讨论与结论：本研究通过代谢组、转录组与定量蛋白质组联合分析，阐明西瓜果肉颜色分化的分子基础。不同果肉颜色表型与类胡萝卜素组成及相对积累模式差异密切相关，红肉品系L600番茄红素含量约为黄肉品系XC6的204倍。多组学分析表明果肉颜色变异与番茄红素/β-胡萝卜素分支点的差异调控相关，据此提出由番茄红素、β-胡萝卜素及下游类胡萝卜素相对比例决定果肉颜色的平衡调控模型。序列分析、结构建模与异源功能评价共同提示ClLCYB等位变异促成三品系类胡萝卜素积累模式差异，L600、XC4、XC6携带不同ClLCYB等位背景，对应不同类胡萝卜素谱与β-胡萝卜素积累能力；ClLCYB功能等位变异与番茄红素向β-胡萝卜素转化改变及类胡萝卜素组成相关，可能促成颜色变异。研究结论指出，未来需借助更多基因型、分离群体或适宜验证体系确认上述发现并评估其更广泛适用性。总体而言，本研究揭示了三个西瓜品种间类胡萝卜素积累的品种相关差异，并鉴定ClLCYB等位变异为类胡萝卜素组成与果肉颜色变异的关键候选决定因素，为理解园艺作物果肉颜色变异的分子基础提供依据，并可能助力未来针对目标类胡萝卜素谱与果肉颜色性状的育种。
