《Scientific Reports》：Comparative evaluation of eggshells wastes and tricalcium phosphate as substrates for phosphate and calcium solubilization by arid ecosystem fungal isolates
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真菌能够溶解磷酸三钙（CPh）和蛋壳源钙，从而加速养分可利用性并支持其作为生物肥料的可持续利用。本研究考察了四株真菌分离株——*Aspergillus terreus*（26L）、*Aspergillus fumigatus*（7L）、*Emericella
真菌能够溶解磷酸三钙（CPh）和蛋壳源钙，从而加速养分可利用性并支持其作为生物肥料的可持续利用。本研究考察了四株真菌分离株——*Aspergillus terreus*（26L）、*Aspergillus fumigatus*（7L）、*Emericella nidulans* var *cristata*（1Fcit）和*Aspergillus flavus*（4Fcit）——以蛋壳（EgSh）和磷酸三钙（CPh）作为生长培养基底物时的溶解效率，重点关注pH降低、磷酸盐和钙的释放。所有分离株均显著降低了培养基pH，其中1Fcit（pH 1.2）和4Fcit（pH 1.6）在磷酸三钙底物（CPh）上记录到最强的酸化作用，而蛋壳（EgSh）由于其碳酸盐缓冲能力表现出较为温和的下降。磷酸盐溶解在CPh中更高，26L达到最大值0.26 mg mL?1，相比之下EgSh中最高为0.067 mg mL?1（4Fcit真菌）。相反，钙释放从EgSh中更高，4Fcit真菌和1Fcit真菌分别达到12和8.2 mg mL?1，而26L和7L真菌为弱钙溶解者。这些结果表明真菌活性与培养基酸化（pH）密切相关，且溶解性能具有底物特异性，从生态学视角来看，分离株*Aspergillus terreus*（26L）和*Aspergillus flavus*（4Fcit）显示出最大的生物肥料潜力。
**研究背景与问题**
磷（P）和钙（Ca）是植物生长和代谢所必需的大量营养元素，但其在土壤中的可利用性常因与土壤矿物及其他组分相互作用而被固定。微生物介导的溶解作用，尤其是溶磷真菌（phosphate-solubilizing fungi, PSF）介导的溶解作用，是提高难溶性矿物和有机来源养分生物可利用性的一种可持续且经济有效的方法。包括细菌、真菌和放线菌在内的多种土壤微生物能够通过酸化、螯合和离子交换等机制将难溶性磷酸盐化合物转化为植物可利用形式，其中有机酸产生是最主要的途径。尽管对细菌溶磷菌已有广泛研究，但丝状真菌在富钙有机残余物（包括蛋壳）生物转化中的潜力受到的关注相对有限。曲霉属（*Aspergillus*）和青霉属（*Penicillium*）等真菌因能产生有机酸（尤其是葡萄糖酸和柠檬酸）促进矿物溶解和养分活化而被认为是高效的溶磷菌。蛋壳是一种丰富且可再生的农工业废弃物，富含钙和微量元素，其主要结构成分为碳酸钙（CaCO?），此外还含有钾、氮、镁、磷等大量元素以及锌等微量元素，并含有糖醛酸、唾液酸和氨基酸等生物活性化合物。蛋壳废弃物在填埋场的积累带来显著的环境和经济问题。蛋壳作为不可再生石灰石资源的可持续替代品在农业中具有特殊价值，其高碳酸钙含量使其适合作为土壤改良剂。然而，尽管蛋壳作为营养丰富底物的潜力已获认可，但关于真菌菌株利用蛋壳废弃物作为钙和磷双重来源以改善养分活化和生物可利用性的研究相对较少。这一知识空白凸显了探索基于真菌的方法以实现蛋壳残余物可持续增值的必要性。因此，本研究旨在评估所选真菌分离株从蛋壳和磷酸三钙中溶解钙和磷酸盐的能力，并评估pH变化与养分溶解效率之间的关系，以确定这些真菌在可持续养分管理和生物肥料开发中的潜力。
**关键技术方法**
研究人员采用四株内生真菌分离株：*Aspergillus terreus* 26L（登录号KY053112.1）、*Aspergillus fumigatus* 7L（登录号PQ876086），分离自埃及阿斯旺大学校区（24°5′15″N，32°53′56″E）采集的*Eucalyptus camaldulensis*叶片；以及*Aspergillus flavus* 4Fcit（登录号LC480514）和*Emericella nidulans* var *cristata* 1Fcit（登录号MH041174.1），分离自*Citrullus colocynthis*根系。菌株经马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养并保存。蛋壳经清洗、70 °C干燥3 h、研磨过0.5 mm筛并灭菌后使用。定量溶解试验在改良Pikovskaya（PKV）液体培养基中进行，分别以磷酸三钙（TCP，5.00 g/L）或蛋壳粉（EgSh，10 g/L）作为唯一磷源和钙源，在28 °C、200 rpm条件下培养0、3、6、9和12天，每个处理设三个重复。磷酸盐溶解采用钒钼酸盐法于430 nm比色测定；钙溶解采用EDTA滴定法测定；pH使用数字pH计监测。数据采用Python 3.10.12及Matplotlib 3.8.0和Pandas 2.1.1进行分析，显著性差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey多重比较检验（p < 0.05）。
**研究结果**
**pH变化**：在磷酸三钙（CPh）培养基中，初始pH值因分离株不同在7.0至9.8之间，随培养时间明显下降。1Fcit和4Fcit酸化最为显著，第12天pH分别降至1.2和1.6。26L呈中度下降，稳定在4.5左右；7L维持在5.0以上。未接种对照仅略有下降。在蛋壳（EgSh）底物上，pH下降趋势类似但幅度较小，4Fcit酸化最强（第12天pH 2.8），其次为1Fcit（pH 4.8）和26L（pH 5.0），7L降幅最小（pH保持在6.4以上）。CPh中的pH降幅大于EgSh，表明蛋壳（CaCO?）的较高缓冲能力限制了酸化程度。4Fcit在两种底物上均为最有效的产酸者，而1Fcit在CPh上特别有效但在EgSh上较弱。
**磷酸盐溶解**：两种底物上磷酸盐溶解在接种后迅速开始，在第5至7天达到峰值，随后逐渐下降或稳定。未接种对照未检测到溶解。在CPh底物中，26L表现出最高的磷酸盐溶解能力，第7天达到0.26 mg/mL；4Fcit和7L溶解中等水平（第5天分别为0.17–0.20 mg/mL）；1Fcit溶解能力较弱（第5天0.15 mg/mL）随后迅速下降。在EgSh底物中，4Fcit为最佳溶磷者，第5天达到0.067 mg/mL，随后显著下降；1Fcit溶解能力中等（第5天0.033 mg/mL）并保持相对稳定；26L和7L溶解能力较差（0.02 mg/mL）。所有分离株从CPh中溶解的磷酸盐均多于EgSh，反映了矿物组成和溶解机制的差异。26L是CPh底物磷酸盐的最强溶解者，而4Fcit在蛋壳底物上表现优异，表明底物特异性效率。
**钙溶解**：与CPh相比，蛋壳主要成分为碳酸钙，在真菌处理下释放显著更高浓度的可溶性钙。4Fcit是最有效的钙溶解者，持续释放钙至第9天达到约12 mg mL?1，第12天略有下降。1Fcit也表现出较强的钙释放能力，第9天峰值达8.2 mg mL?1并 thereafter保持较高水平。26L和7L为弱蛋壳钙溶解者，最大浓度低于2.5 mg mL?1。对照处理在整个培养期间变化极小。这些结果表明蛋壳中钙的释放显著高于CPh，反映了蛋壳底物富碳酸盐的矿物学特征在酸化条件下易于溶解。4Fcit和1Fcit观察到的持续钙积累表明这些分离株产生了足够的酸度以克服CaCO?的缓冲能力，从而在培养期间维持持续的钙释放。钙释放高度依赖于真菌分离株和底物类型。
**相关性分析**：热图分析揭示了pH、磷酸盐和钙释放之间依赖于真菌分离株和底物类型的关系。在CPh底物中，多数分离株pH与磷酸盐溶解之间呈弱相关，表明磷酸盐释放与酸化过程并非直接成正比。26L表现出pH与磷酸盐的正相关（r = 0.35），这与其在中等酸化下仍具有较强磷酸盐释放相一致。CPh中钙释放与pH和磷酸盐普遍呈弱相关，表明CPh底物中钙释放有限。在蛋壳底物中，1Fcit和4Fcit均表现出pH与磷酸盐释放之间的显著负相关（r分别为?0.54和?0.53），表明酸化增强促进了磷酸盐溶解。此外，4Fcit表现出磷酸盐与钙之间的显著负相关（r = ?0.60），提示钙（Ca2?）的活化可能通过再沉淀过程降低可溶性磷酸盐的有效性。7L和26L在EgSh上相关性较弱，反映了其从富碳酸盐底物中溶解磷酸盐或钙的有限能力。相关模式证实CPh的磷酸盐溶解较少依赖于酸化过程，而EgSh需要更强的酸化才能释放磷酸盐和钙，但过量的钙释放可能拮抗磷酸盐的有效性。
**讨论与结论**
讨论部分指出，pH、钙和磷酸盐之间的相互作用随底物类型而变化。在CPh培养基中，培养早期pH的急剧下降伴随着可溶性钙和磷酸盐的显著增加，尤其是4Fcit和1Fcit接种的培养基。pH下降主要归因于真菌在生长和代谢过程中分泌有机酸和质子（H?），这些酸可质子化并溶解难溶性矿物化合物。蛋壳主要由CaCO?组成，碳酸盐组分赋予其显著的酸中和能力，因此真菌产生的酸和质子在碳酸盐溶解过程中被消耗，pH下降被部分抵消，培养基可保持在相对较高的pH水平。研究趋势支持真菌有机酸释放质子从而同步释放磷酸根阴离子和钙阳离子的经典机制。某些分离株在第7天后钙释放的下降可能表明再沉淀过程或生长后期酸分泌减少。蛋壳底物表现出不同的溶解模式：磷酸盐溶解低于CPh，但4Fcit的钙释放持续时间更长，即使培养基仅中度酸化。这种底物特异性差异表明，在富碳酸盐材料中，持续的产酸和分泌有机酸的具体性质比单纯的pH下降发挥更重要的作用。总体而言，磷酸盐溶解和钙释放与真菌介导的酸化过程紧密相关，但效率和动力学具有底物依赖性。CPh易于响应质子驱动的溶解，允许磷酸盐和钙的快速释放；蛋壳由于其碳酸盐缓冲作用需要延长的酸化过程，导致钙动员延迟但更持久，磷酸盐溶解相对有限。这些发现与先前报道一致，即真菌溶解潜力随底物矿物学性质和分离株代谢能力而变化。酸化与磷酸盐溶解之间的关系不一定是线性的。尽管溶磷真菌产生的有机酸和质子可降低pH并促进磷酸钙（Ca-P）溶解，但磷酸盐释放还取决于所产生有机酸的类型和浓度及其螯合Ca2?的能力。因此，pH降低可被视为真菌酸化的重要指标和Ca-P溶解的促进因素，但不应被视为培养基中可溶性磷酸盐浓度的唯一决定因素。本研究未定量特定有机酸，这是一项局限，值得未来研究。研究结果与*Penicillium hispanicum*的研究一致，其培养pH在6天内从4.15降至2.45以下，与磷酸三钙几乎完全溶解相关。比较研究强化了真菌代谢的底物依赖性，酸化程度和磷酸盐溶解随难溶性磷源的化学组成而变化。在测试的分离株中，4Fcit在两种底物上均为最有效的酸化者，表明其产生了大量有机酸，有利于磷酸盐和CaCO?的溶解。1Fcit在CPh上表现突出但在EgSh上活性中等。这些观察与更广泛的发现一致，即真菌产酸及溶解效率强烈依赖于真菌菌株和底物类型。从机制上讲，二羧酸和三羧酸（如柠檬酸、草酸、苹果酸）的分泌在螯合阳离子和溶解矿物磷酸盐方面比单羧酸更有效。此外，氮源可影响酸化速率：铵态氮同化通常比硝态氮促进更大的培养基酸化。特别是4Fcit和1Fcit显著降低培养基pH并溶解难溶性Ca-P底物的能力，凸显了其作为生物肥料候选者改善土壤磷有效性的潜力。在农业土壤中，相当一部分磷以难溶性矿物形式（如钙、铁和铝磷酸盐）存在，对植物基本不可利用。施用溶磷真菌已被证明可增强磷有效性、提高养分吸收效率并减少对化学磷肥的依赖。在CPh上更强的pH降低和溶解活性表明这些分离株在碱性或石灰性土壤中可能特别有效，因为在这些土壤中磷被Ca2?离子固定。同时，酸化并溶解蛋壳中CaCO?的能力支持这些真菌在农工业废弃物生物循环利用中的潜在应用，将蛋壳转化为植物可利用钙和磷的来源。重要的是，本研究的分离株在溶解能力上存在差异，表明菌株选择对田间成功至关重要。4Fcit等在两种底物上均表现出广泛效率的分离株对多样化土壤环境更具前景。此外，溶磷真菌与其他植物促生微生物（如固氮菌或菌根真菌）共接种已被证明可在田间条件下协同增强植物养分获取和产量。在两种底物上，可溶性磷酸盐在培养第3至7天急剧达到峰值后显著下降，具有分离株和底物特异性响应。这些动态与真菌溶磷主要由有机酸分泌驱动相一致，有机酸酸化培养基、螯合与磷酸盐结合的阳离子并促进Ca-磷酸盐矿物的溶解。在底物效应方面，所有分离株从CPh释放的磷酸盐均显著多于EgSh。这是预期之中的，因为蛋壳是富含CaCO?的生物矿物（94% CaCO?，仅含1% Ca-磷酸盐），可利用磷酸盐库本质上较小，且CaCO?溶解需要持续产酸以克服缓冲作用，使净磷酸盐释放比CPh更慢更低。26L在CPh上的强性能与4Fcit在EgSh上的优异性能表明真菌间酸谱和溶解策略的差异。不同有机酸（如葡萄糖酸、柠檬酸、草酸）在pKa和与Ca2?的络合强度方面存在差异，这种差异可有利于特定矿物或基质的溶解。可溶性磷酸盐在第3至7天出现早期峰值随后下降，可能反映了释放的正磷酸盐与Ca2?离子的再沉淀。当酸化剂或螯合剂耗尽或pH恢复时，该过程可能发生。钙-磷酸盐复合物的沉淀在水溶液系统和微生物培养环境中均有充分文献记载。微生物溶解机制不仅依赖于酸化，有机酸产生、螯合和酶活性均有助于钙磷酸盐（如羟基磷灰石和透钙磷石）的溶解。在本研究中，数据支持这种多因素模型，特别是在尽管pH变化极小但仍维持溶解活性的分离株中，表明替代生化途径发挥重要作用。Ca-磷酸盐比其他磷酸盐矿物响应更强，研究结果符合更广泛的模式，即许多溶磷微生物（包括真菌）更容易溶解Ca-磷酸盐（TCP/羟基磷灰石）而非Fe-或Al-磷酸盐，因为质子/配体促进的溶解和Ca-螯合对Ca结合磷酸盐特别有效。26L（CPh）和4Fcit（EgSh）表现出显著的磷酸盐溶解能力和植物促生特性，使其成为生物投入品开发的有前景候选者，然而其性能受底物化学性质的显著影响。为优化田间功效，菌株选择应以目标土壤中主要的难溶性磷酸盐库为指导。这种底物-微生物兼容性框架日益被认为是将在体外溶解潜力转化为多变土壤条件下一致农艺效益的关键。CPh比EgSh更快更高的磷酸盐释放与矿物学一致：磷灰石/TCP对有机酸攻击响应强烈；蛋壳的CaCO?基质缓冲酸且含有较少的内在磷酸盐。分离株特异性（26L在CPh上；4Fcit在EgSh上）可能反映了不同的有机酸组合和螯合强度，这些控制着溶解与再沉淀之间的平衡。钙从CPh和EgSh中的释放表现出显著的分离株和底物依赖性。蛋壳主要由CaCO?（>90%）组成，仅含少量磷酸盐，而CPh是Ca-磷酸盐矿物（Ca?(PO?)?）。这些组成差异决定了溶解途径，CaCO?在酸化条件下比Ca-磷酸盐更易溶解。在测试的分离株中，4Fcit在两种底物上均表现出最强的溶解能力，从EgSh释放12 mg mL?1 Ca，从CPh释放约5.5 mg mL?1 Ca，表明4Fcit分泌大量有机酸能够降低pH并溶解钙盐，与真菌有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸和草酸）能强烈螯合Ca2?并增加矿物溶解的报道一致。1Fcit也动员了高水平钙，尤其是从蛋壳中（8.2 mg mL?1），支持产酸真菌对碳酸盐形式特别有效的观点。相比之下，26L和7L释放钙缓慢且浓度较低，表明产酸相对较弱或溶解模式不同。钙释放的时间动态进一步凸显了真菌活性与矿物缓冲之间的相互作用。对于TCP，钙浓度在第5至7天达到峰值后下降，可能反映了培养基pH稳定时钙盐的再沉淀或钙被吸收进入真菌生物量和胞外聚合物。然而在蛋壳培养基中，钙释放更为持久，尤其是4Fcit和1Fcit，表明这些真菌维持了足够的产酸以克服碳酸钙的高缓冲能力。这些发现与先前数据一致，表明微生物磷酸盐溶解与钙动态紧密相关。高钙释放通常与碳酸盐或磷灰石溶解相关，但并不几乎与磷酸盐溶解成正比，因为磷酸盐在较高pH下可迅速与Ca2?再沉淀。这在本研究中表现明显：26L释放较少钙但从CPh中实现了最高的磷溶解，而4Fcit释放最多钙但仅有中等磷溶解，表明在将磷酸盐释放与大量钙溶解解耦方面存在不同效率。本研究观察到的pH、磷酸盐和钙释放之间的相关模式凸显了真菌溶解矿物磷酸盐的底物特异性机制。弱相关表明pH降低不能解释CPh磷酸盐溶解的变异。尽管真菌酸化可促进CPh溶解，但其他真菌介导的过程也可能有助于磷酸盐释放。因此，酸化是影响磷酸盐溶解的重要因素但非唯一因素。26L表现出磷酸盐释放与pH的正相关（r = 0.35），表明其高溶解效率可能涉及螯合、酶活性或产生独立于剧烈酸化的有机配体等额外机制。类似发现已在其他溶磷真菌中报道，其中有机酸产生并非溶解效率的唯一决定因素。1Fcit对含TCP培养基产生最强酸化，最终pH达1.2，但在测试分离株中磷酸盐溶解最低。这一发现表明仅pH降低不能完全解释真菌分离株间观察到的磷酸盐溶解差异。尽管通过质子释放和有机酸产生的酸化是溶解难溶性矿物磷酸盐的成熟机制，但磷酸盐溶解是一个多因素过程，还可能涉及有机酸介导的Ca2?螯合、配体交换以及微生物代谢物与矿物底物之间的其他相互作用。先前研究报道微生物降低环境pH的能力不一定与其溶解矿物磷酸盐的能力相关，表明酸化以外的机制可能有助于磷酸盐释放。因此，1Fcit观察到的显著pH下降应被视为强酸化的证据而非优越溶磷活性的直接证据。在四种测试分离株中，4Fcit在两种测试底物上均表现出最大的pH下降，表明在实验条件下具有相对较高的产酸能力。这种响应可能与真菌生长期间有机酸的增强产生和分泌有关，从而增加质子可利用性并促进培养基酸化。先前研究已证明溶磷真菌在产生有机酸的类型和数量上存在显著差异，导致不同程度的培养基酸化和矿物溶解。相比之下，蛋壳底物上的相关性揭示了更清晰的酸化依赖性趋势。1Fcit和4Fcit均表现出pH与磷酸盐释放之间的强负相关（r分别为?0.54和?0.53），表明CaCO?结合磷酸盐的溶解需要显著酸化。这与先前报道一致，即碳酸盐结合磷酸盐的溶解主要受质子释放和培养基酸化控制。4Fcit中磷酸盐与钙之间的负相关（r = ?0.60）表明过量的Ca2?释放可能促进磷酸盐再沉淀，这在碳酸盐系统中是广泛认可的现象。这种拮抗关系意味着虽然酸化对释放两种离子至关重要，但过量的钙可利用性可通过二次沉淀反应降低可溶性磷酸盐，因为释放的钙离子可与培养基中的磷酸根离子反应并促进难溶性二次钙磷酸盐的形成。尽管真菌酸化最初促进CPh溶解并向溶液中释放磷酸盐，但过量的Ca2?可利用性可能随后导致部分释放的磷酸盐沉淀，从而降低其在可溶组分中的浓度。7L和26L在EgSh上表现出较弱或不一致的相关性，反映了其从碳酸盐底物中有限的溶解能力。这进一步强调了真菌效率高度依赖于分离株，并与其维持足够酸化以对抗CaCO?强缓冲能力的代谢能力相关。这种底物特异性差异与先前研究一致，表明磷酸盐溶解效率不仅因真菌物种而异，还因磷源的矿物学组成而异。总体而言，这些发现表明真菌磷酸盐溶解是一个多因素过程：虽然酸化对富碳酸盐底物至关重要，但pH降低以外的额外机制可能在从磷酸三钙中动员磷酸盐方面发挥主导作用。重要的是，蛋壳上钙释放与磷酸盐有效性之间的负相互作用凸显了在评估生物肥料应用真菌菌株时需要考虑酸化与离子动态之间的平衡。本研究证明真菌分离株表现出不同的酸化培养基和溶解磷酸盐及钙的能力，取决于底物类型。pH降低通常在CPh上比在EgSh上更明显，显示了CaCO?更强的缓冲能力。磷酸盐溶解从CPh中更高，26L最为有效，而4Fcit在EgSh上表现出最高活性。钙释放从蛋壳中显著更高，尤其是4Fcit和1Fcit，证实了蛋壳底物的钙质性质。相关性分析揭示在EgSh上磷酸盐溶解强烈依赖于酸化过程，而在CPh上pH降低以外的额外机制也有助于溶解。EgSh上钙与磷酸盐之间的负相关进一步提示高钙（Ca2?）释放下的再沉淀效应。尽管磷酸三钙在整个实验过程中提供了更高的可溶性磷酸盐水平，但蛋壳释放了显著更大量的生物可利用钙，尤其是当被4Fcit和1Fcit代谢时。这种磷酸盐（即使水平较低）和丰富钙的双重释放表明，蛋壳作为低成本农业副产品，可作为磷酸三钙的有效且可持续的替代生物肥料，特别是在缺钙或碱性土壤生境中。结论：所研究的真菌分离株表现出不同的酸化培养基底物和溶解磷酸盐及钙的能力，其性能受磷源强烈影响。磷酸三钙（CPh）支持的磷酸盐溶解高于蛋壳（EgSh），而蛋壳由于其富碳酸盐组成释放更高量的钙。真菌分离株26L对CPh的磷酸盐释放最为有效，但4Fcit在EgSh上超越之并实现了最高的钙释放。酸化与溶解效率相关，4Fcit和1Fcit产生最强的pH降低。从整体视角看，26L和4Fcit两个真菌分离株显示出有前景的生物肥料潜力，但其效率具有底物特异性，凸显了矿物来源在决定真菌介导养分释放中的重要性。
