来自香菇（Lentinula edodes）的一种对Ca2?有响应的GH37中性海藻糖酶：克隆、异源表达及生化特性分析

《Enzyme and Microbial Technology》：A Ca2?-responsive GH37 neutral trehalase from Lentinula edodes: Cloning, heterologous expression and biochemical characterization

　　

摘要

海藻糖酶（EC 3.2.1.28）能将海藻糖水解为两个葡萄糖分子，在真菌的海藻糖代谢中起着重要作用。尽管已经在酵母和丝状真菌中表征了GH37中性海藻糖酶，但其 在担子菌中的生化特性仍知之甚少。在本研究中，我们从Lentinula edodes中克隆了LeNTH1基因（一种推测的GH37海藻糖酶），并在Pichia pastoris中表达了该基因，并对纯化的重组酶进行了表征。推导出的蛋白质包含745个氨基酸残基，并含有一个预测的N端信号肽。纯化的重组酶优先水解海藻糖，在pH 7.0和30°C时具有最高活性，并且在较宽的pH范围内稳定。预先使用CaCl?处理能够以浓度依赖的方式增强rLeNTH1的活性，在10 mM CaCl?处理后其活性约为对照组的3.3倍。CaCl?还提高了热稳定性：在50°C下孵育120分钟后，存在5或10 mM CaCl?时仍保留约45%的初始活性，而在0–2.5 mM CaCl?时则不到13%。这些结果表明添加的Ca²⁺可以同时增强rLeNTH1的活性和热稳定性，尽管尚未直接证明Ca²⁺与其结合。在子实体的粗提物中，中性海藻糖酶的活性在成熟过程中增加，而LeNTH1的转录水平几乎保持不变。由于活性测定并不特异于LeNTH1，因此其对此变化的贡献仍不明确。这些发现为民称菌GH37海藻糖酶的生化多样性提供了证据。

引言

海藻糖是一种非还原性二糖，在真菌中广泛分布，作为储存碳水化合物和应激保护化合物发挥着重要作用。在蘑菇中，海藻糖会在子实体中积累，并被认为在子实体发育过程中被分解以提供能量和碳源[[1], [2], [3], [4], [5]]。因此，参与海藻糖代谢的酶对于理解真菌生长和发育过程中的碳水化合物利用非常重要。海藻糖由海藻糖酶（EC 3.2.1.28）水解为两个葡萄糖分子。根据最适pH值、细胞定位和序列特征，真菌海藻糖酶通常被分类为酸性海藻糖酶（ATHs）和中性海藻糖酶（NTHs）[[6], [7], [8], [9]]。在酵母和丝状真菌中，ATHs通常与细胞外或液泡中的海藻糖降解相关，属于糖苷水解酶家族65（GH65），而NTHs通常在中性pH值下在胞质中发挥作用，属于糖苷水解酶家族37（GH37）[10,11]。然而，担子菌中海藻糖酶的特性仍不甚清楚。

相比酵母和丝状真菌，担子菌蘑菇中的海藻糖酶研究较少。之前已从Lentinula edodes中纯化出一种细胞外酸性海藻糖酶[12]。最近，从Pleurotus属中克隆并表征了一种最适pH值为酸性的GH37海藻糖酶[13]。这一发现表明，不能仅根据GH37分类来确定担子菌海藻糖酶的生化pH偏好。

在研究L. edodes的海藻糖代谢过程中，我们鉴定出一个推测的GH37海藻糖酶基因LeNTH1。推导出的氨基酸序列包含GH37海藻糖酶特有的催化基序和一个预测的N端信号肽，表明其可能通过分泌途径表达。然而，无论是GH37分类还是信号肽的存在，都不能确定该酶的生化pH偏好或最终的细胞定位。因此，我们克隆了全长LeNTH1 cDNA，在Pichia pastoris中表达了重组酶，并研究了其底物特异性、pH和温度依赖性、稳定性以及对金属离子的反应。同时将其生化特性与之前从Pleurotus属中表征的GH37酸性海藻糖酶[13]进行了比较。

章节片段

化学品

海藻糖购自FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation（日本大阪）。可溶性淀粉购自Kanto Chemical Co., Inc.（日本东京）。本研究中使用的其他所有化学品均为分子生物学或分析级。

蘑菇菌株

一种新开发的Lentinula edodes品种由Hokuto Corporation（日本长野）提供。根据我们研究小组建立的形态学标准，将发育阶段（第1–12阶段）进行了定义（图S1）。

Lentinula edodes中性海藻糖酶基因（LeNTH1）的克隆和序列分析

从L. edodes的子实体中克隆了LeNTH1的全长cDNA。该核苷酸序列已存入DDBJ/ENA/GenBank数据库，登录号为LC940500。该cDNA包含一个2235 bp的开放阅读框，编码一个745个氨基酸残基的蛋白质。SignalP预测存在一个N端信号肽，覆盖残基1–63，表明LeNTH1可能通过分泌途径表达。然而，LeNTH1的天然细胞定位尚未通过实验验证。

讨论

本研究描述了来自Lentinula edodes的GH37中性海藻糖酶LeNTH1的克隆、异源表达和生化特性。尽管推导出的氨基酸序列含有N端信号肽，并且与先前报道的Pleurotus属酸性海藻糖酶[13]具有高序列相似性，但纯化的重组酶表现出中性pH值的最适活性，并优先水解海藻糖。这些结果表明LeNTH1的生化pH偏好

结论

在本研究中，我们克隆并生化表征了来自Lentinula edodes的GH37海藻糖酶LeNTH1。推导出的序列包含一个预测的N端信号肽，而纯化的重组酶表现出中性pH值的最适活性，并在所检测的底物中优先水解海藻糖。预先使用CaCl?处理可以以浓度依赖的方式增强rLeNTH1的活性，较高的CaCl?浓度还能提高其热稳定性。然而，尚未直接证明Ca²⁺与其结合

CRediT作者贡献声明

Yui Nakamura：撰写——初稿、验证、方法学、实验研究。 Satoshi Mototsuji：验证、方法学、实验研究。 Mizuho Kusuda：资源提供、数据分析。 Kengo Kamei：资源提供、数据分析。 Masae Maruyama：资源提供、实验研究。 Shinji Harada：资源提供、项目管理。 Mariko Ishikawa：资源提供、项目管理、数据整理。 Hitoshi Kobayashi：监督、资源提供。 Kenji Ouchi：概念构思。 Satoshi Inatomi：资源提供。

伦理批准

不适用。本研究未涉及人类参与者或动物。

在准备和修改本手稿期间，作者使用了ChatGPT（OpenAI）来辅助语言润色、组织和改进文章的清晰度。作者对所有AI辅助内容进行了严格审查和编辑，并对文章的最终内容负全责。

本工作得到了Hokuto Corporation的支持。未分配任何资助或奖励编号。资金的接收者是Mitsuhiro Ueda。

Mariko Ishikawa、Shinji Harada、Masae Maruyama、Hitoshi Kobayashi和Satoshi Inatomi是Hokuto Corporation的 employees，该公司为本文的研究提供了资金支持。其余作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

Yui Nakamura|Satoshi Mototsuji|Mizuho Kusuda|Kengo Kamei|Masae Maruyama|Shinji Harada|Mariko Ishikawa|Hitoshi Kobayashi|Kenji Ouchi|Satoshi Inatomi|Mitsuhiro Ueda 大阪市立大学农业研究生院，日本大阪，599-8531