经过底物结合口袋和通道工程改造的Marinobacter subterrani去乙酰酶的定向进化：用于增强除草剂前体物质的合成

《Enzyme and Microbial Technology》：Structure-guided evolution of Marinobacter subterrani deacetylase for enhanced herbicide precursor synthesis by substrate-binding pocket and channels engineering

　　

摘要

脱乙酰酶可以直接水解酰胺键，用于环保合成除草剂中间体O-(3-氯-2-丙烯基)羟胺。然而，N-[(E)-3-氯丙-2-烯氧]乙酰胺（NECA）中刚性的卤化链可能会阻碍底物的有效定位，并限制催化效率。因此，最初筛选了20种脱乙酰酶，最终从Marinobacter subterrani中鉴定出一种脱乙酰酶（MsDeac）作为最佳候选底物。为了提高其对NECA的催化性能，研究人员采用了一种协同作用策略，通过重塑底物结合口袋和通道来改进底物结合环境及访问路径。分子对接分析表明，M3位点可能存在卤素键合，这有助于底物定位。此外，M3的口袋体积由777 ?³扩大到1055 ?³，且预测的通道数量也有所增加。经过逐步诱变后，成功获得了 triple 突变体（Y325H-M321H-Y170H, M3），其催化效率（k_cat/K_m）提高了68倍，80 mM NECA的转化率从约10%提升到超过99.5%，仅需12小时。结果表明，改进的空间互补性和潜在的卤素键合相互作用有助于提升催化效率，为脱乙酰酶适应立体挑战性底物提供了结构依据。

引言

由于酶催化剂具有显著的效率和选择性，它们被认为是绿色化学的基石，在制药、农用化学和精细化工行业中具有巨大的应用潜力[1]。天然进化而来的酶通常对天然代谢物具有严格的特异性。然而，工业过程需要酶对非天然底物具有广泛的适应性[2]。克服这一障碍的紧迫性体现在O-(3-氯-2-丙烯基)羟胺（OCH）的合成上，它是多种除草剂（如clethodim和tepraloxydim）的关键中间体。传统的化学脱乙酰化方法需要苛刻的条件，通常使用浓盐酸[3,4]，这会导致大量废盐的产生（每吨产品产生约1.5–2吨盐[5]）。除了严重的环境负担外，这些方法还存在安全隐患，包括设备腐蚀和潜在的爆炸风险[6]。因此，开发一种温和且环境友好的生物催化策略不仅是学术目标，也是工业上的迫切需求。

能够在温和条件下催化乙酰胺基团水解的脱乙酰酶是一个有前途的选择[7]。这些酶在多种应用中展现出巨大价值，从β-内酰胺类抗生素的生物合成到几丁质和壳聚糖的改性[8,9]。然而，尽管在天然环境中应用广泛，但由于底物特异性的限制，脱乙酰酶在合成分子中的工业应用仍受到限制。

最近的研究试图通过重塑活性位点的口袋来扩大脱乙酰酶的底物范围[5]。虽然针对催化腔内的靶向诱变可以提高对通用乙酰化底物的亲和力，但面对N-[(E)-3-氯丙-2-烯氧]乙酰胺（NECA）的复杂性时，这种“以口袋为中心”的修改仍然不够充分。尽管有所改进，NECA的线性且刚性的烯基链仍可能对其在催化口袋中的定位产生几何限制[10]，末端氯原子也可能引入额外的空间和电子限制[11,12]。计算分析表明，即使扩大了结合口袋，长链卤化部分的进出仍可能存在迁移限制，而仅通过活性位点工程可能无法完全解决这些问题。

为了解决这一空间瓶颈，本研究旨在提高MsDeac对NECA的催化性能，并评估协同工程化底物结合口袋和通道是否有助于改善这种立体要求高的底物的适应性。通过AlphaFold2结构建模、分子对接和残基分析，研究人员确定了影响口袋几何形状、局部疏水环境和底物访问路径的位置。对这些位置进行迭代诱变和活性筛选后，再对选定的突变体进行动力学分析和计算评价。通过将口袋重塑与通道工程相结合，本研究试图建立一种结构引导策略，以帮助脱乙酰酶适应立体要求高的非天然底物。

章节片段

材料与试剂

质粒提取试剂盒、大肠杆菌菌株（DH5α和BL21 (DE3)）以及His-Tag纯化琼脂糖购自Sangon Biotech Co., Ltd.（中国上海）。限制性内切酶由Beyotime和Vazyme（中国）提供。引物合成和DNA测序由Tsingke Biotechnology Co., Ltd.（中国杭州）完成。其他所有化学品和试剂均为分析级，除非另有说明，否则均按商品原样使用。

在初步...

为了识别具有降解氯乙酰胺潜力的脱乙酰酶，从UniProt数据库中选取了多种物种的候选酶。鉴于某些已知脱乙酰酶依赖NAD?作为辅因子，而在工业应用中添加或再生NAD?会大幅增加成本，本研究特别关注不依赖辅因子的脱乙酰酶。通过这种筛选策略共获得了20种脱乙酰酶。

本研究证明了协调工程化底物结合口袋和预测的通道区域是提高MsDeac对NECA催化性能的有效方法。所得M3突变体的催化效率提高了68倍，80 mM NECA的转化率在12小时内超过了99.5%，显示出显著的动力学和制备方面的改进。计算结果与实验观察结果一致。

黄茵峰：撰写 – 原初稿、方法学设计、数据分析。魏典茹：撰写 – 审稿与编辑、实验研究。文欢：方法学设计。崔玉芝：方法学设计。邹淑萍：项目指导、资源协调、资金筹集、概念构思。薛雅萍：项目监督。郑玉国：项目监督。

作者享有以下非独占权利：(1) 在教学活动中使用该手稿；(2) 发表该手稿或允许他人发表该手稿。

本研究/项目得到了中国国家重点研发计划（项目编号2025YFC3409600）的支持。

黄茵峰|魏典茹|文欢|崔玉芝|邹淑萍|薛雅萍|郑玉国

浙江工业大学生物技术与生物工程学院绿色化学合成与转化国家重点实验室，杭州，310014，中国