通过组合优化核糖体结合位点、启动子及基因组位点，在Streptomyces mobaraensis中实现高效生产耐热转谷氨酰胺酶

《Enzyme and Microbial Technology》：Combinatorial optimization of ribosomal binding site, promoter and genomic locus for high-yield production of a thermostable transglutaminase in Streptomyces mobaraensis

　　

摘要

Streptomyces mobaraensis 的转谷氨酰胺酶（smTG）是一种重要的食品加工生物催化剂，但其工业潜力受到产率低和热不稳定性的限制。本文报道了对 S. mobaraensis smY2022 的多级工程改造，以高产率生产出一种耐热变体 TGm2。基于 RBS Calculator 的预测，通过 ab initio 设计出核糖体结合位点（RBS），得到了 RBS10，使得 TGm2 的产率提高了 22%。将 SD 序列和起始密码子之间的间隔延长至 6 个碱基（RBS10–1）后，产率进一步提高了 19%。通过恢复上游调控位点（两个 AdpA 结合位点和一个 LytR 结合位点）对原生 smTG 启动子进行工程改造，得到了 P_smY2022–2，其表达量比截短后的启动子提高了 145%。将优化后的表达盒（P_smY2022–2:RBS10–1:TGm2）整合到 smTG 位点后，获得了 smY2022-TGm2-S 菌株（产量为 72.5 微摩尔/毫升）。通过基因组位点筛选，找到一个高表达位点（K7I03_09295）；在该位点插入第二个拷贝后，获得了 smY2022-TGm2-S-09295 菌株，其活性达到了 102.9 微摩尔/毫升的记录水平。本研究为 Streptomyces 中的工业酶生产提供了一种高效、高产的菌株和组合工程策略。

引言

转谷氨酰胺酶（EC 2.3.2.13, TGase）能够催化蛋白质中的谷氨酰胺残基与不同酰基受体之间的反应，形成 ε-(γ-谷氨酰胺) 异肽键，从而实现蛋白质的交联或小分子的修饰。[1] Streptomyces mobaraensis 的 TGase（smTG）是最早分离出的微生物转谷氨酰胺酶。[2] 与来自植物和动物的 TGase 相比，smTG 不需要 Ca²⁺ 来维持其活性，且更具成本效益。[1] 因此，S. mobaraensis 的发酵是食品工业中商业 TGase 的主要来源。到目前为止，smTG 还在抗体-药物偶联[3]、组织工程[4]和蛋白质聚乙二醇化[5]等领域展现出广阔的应用潜力。然而，S. mobaraensis 的野生型 TGase 热稳定性较差，在 50°C 时的半衰期仅为 41.8 分钟，在 60°C 时仅为 2 分钟。这种稳定性不佳限制了其更广泛的工业应用，包括牛肉凝胶化和豆腐制造等工艺。[6,7] 因此，高效生产耐热 TGase 变体对实际工业应用具有重要意义。

迄今为止，已经采用了随机突变或半互补等策略来提高 S. mobaraensis TGase 的热稳定性。例如，研究人员通过随机突变[8]和组合突变[9]开发出了耐热突变体 TGm1（S2P-S23V-Y24N-S199A-K294L），其在 60°C 时的半衰期为 24.3 分钟，比野生型酶长约 11.2 倍。[10] 此外，我们还构建了两种额外的耐热变体：FRAPD-TGm2（S2P-S23V-Y24N-E28T-S199A-A265P-A287P-K294L）和 FRAPD-TGm3（S2P-S23V-Y24N-E28T-N96E-S144E-N163D-R183E-S199A-R208E-A265P-A287P-K294L-K325E）[11]。在 60°C 时，FRAPD-TGm2 和 FRAPD-TGm3 的半衰期分别达到 66.87 分钟和 122.91 分钟。[11] 尽管 FRAPD-TGm3 具有更高的热稳定性和特异性活性（83.74 U/mg），但其蛋白质交联活性远低于野生型 TGase 和 FRAPD-TGm2。[11] 因此，FRAPD-TGm2 可能具有更大的实际应用潜力。需要注意的是，尽管这些耐热 TGase 突变体通常在大肠杆菌（E. coli）中表达，但它们的安全性表现和产率仍有待进一步提高。

除了 E. coli 之外，smTG 还已在多种异源宿主中表达，包括 Streptomyces lividans、[12] Lactococcus lactis、[13] Corynebacterium glutamicum、[14,15] Bacillus subtilis、[16] Pichia pastoris 和 Yarrowia lipolytica。[18] 在野生型 S. mobaraensis 中，TGase 最初以无活性的前体形式合成，随后通过内源性蛋白酶（如金属蛋白酶[19]、丝氨酸蛋白酶[20] 和三肽氨肽酶[21]）去除其 N 末端前体区域而活性化。值得注意的是，前体区域在促进成熟酶的正确折叠中起着关键作用。[22] 由于大多数异源系统中缺乏天然激活蛋白酶，因此采用了多种策略来实现功能性 TGase 的表达，包括与激活蛋白酶[14] 或前体区域的共表达[23]，以及设计自切割前体结构[24,25]。然而，在这些宿主中的活性 TGase 生产仍然有限，通常导致产率低[26]或细胞内积累[25]。最近，我们在 S. mobaraensis 突变体 smY2022 中表达了 TGm2，获得了 61.7 微摩尔/毫升的细胞外活性——这是迄今为止报道的最高 TGase 活性值。[27] 因此，与其他异源系统相比，S. mobaraensis》是表达耐热 TGase 变体的特别有竞争力的宿主。

在本研究中，通过启动子工程和多位点整合表达盒，显著提高了 S. mobaraensis 中 TGm2 的产量。由此产生的重组菌株能够高效生产耐热 TGase，适用于高温条件下的工业生产和应用。此外，改造后的启动子和选定的整合位点也有助于在 S. mobaraensis 及其他 Streptomyces 宿主中表达其他酶或功能性蛋白。

章节片段

菌株和质粒

TGm2 的宿主菌株是我们在先前研究中筛选得到的 S. mobaraensis 突变体 smY2022。[27] 使用 E. coli JM109 和 E. coli DH5α 进行基因克隆。质粒 pJTU1278[28] 用于在 Streptomyces 中构建双交叉质粒。质粒 pSET152 用于将 TGase 表达盒整合到 Streptomyces 染色的 attB 位点。来自中国 MiaoLingBio 的质粒 pCRISPomyces-2 用于 CRISPR/Cas9 介导的整合

RBS 区域的优化增强了 TGm2 的表达

为了优化 RBS，我们使用 RBS Calculator 软件从头设计了 TGm2 表达盒中的 RBS 区域。[31] 根据预测的翻译起始率（TIR），选择了 11 个 RBS 序列，其 TIR 值是原始 RBS（RBSwt）的 0.5 到 138 倍（见表 S2）。这些 RBS 变体被克隆到特定位点整合质粒 pSET152-TGm2 中，生成了一系列具有不同 RBS 变体的 TGm2 表达质粒（

讨论

与哺乳动物或植物来源的转谷氨酰胺酶相比，Streptomyces 的 TGase 具有明显的优势，主要体现在它们不依赖 Ca²⁺ 的催化活性以及适合低成本微生物大规模生产。[39] SmTG 是目前唯一可商业获得的食品级酶。然而，其天然的产率和热稳定性仍不足以满足广泛的工业应用需求。[4,10] 在我们之前提高 smTG 热稳定性和催化活性的基础上

结论

总之，本研究系统地评估和优化了影响 S. mobaraensis 中 TGm2 高水平表达的关键遗传因素——RBS、启动子调控区域、整合位点和拷贝数。工程改造的元件（例如高 TIR 的 RBS 变体、改进的启动子 P_smY2022–2）以及确定的高表达基因组位点为在该宿主中表达其他异源蛋白提供了有价值的工具箱。最终得到的工程菌株 smY2022-TGm2-S-09295

Xiaofei Hu： 书写 – 原初稿撰写、审阅与编辑、可视化、数据分析、数据整理。Jiacai Ye： 可视化、数据分析、数据分析。Jingwen Zhou： 书写 – 审阅与编辑、概念构建、项目管理、监督。Guocheng Du： 书写 – 审阅与编辑、概念构建、项目管理、监督。Song Liu： 书写 – 审阅与编辑、概念构建、项目管理、监督。

资助

本工作得到了农业科学技术重大项目的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

Xiaofei Hu|Jiacai Ye|Jingwen Zhou|Guocheng Du|Song Liu

江南大学未来食品科学中心，中国江苏省无锡市蠡湖路 1800 号，214122