《Domestic Animal Endocrinology》：Does Horse Castration Impact Osteoarticular Metabolism?
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研究人员评估了去势所致的性腺类固醇剥夺对马骨关节代谢的影响。为此，研究人员比较了在骨骼生长期（青春期后阶段）去势的马与在骨骼成熟后（成年期）去势的马。在去势前及术后9个月内，研究人员测定了两组马循环类固醇激素（睾酮和雌二醇）浓度；同时定量检测了与骨和软骨代谢相
研究人员评估了去势所致的性腺类固醇剥夺对马骨关节代谢的影响。为此，研究人员比较了在骨骼生长期（青春期后阶段）去势的马与在骨骼成熟后（成年期）去势的马。在去势前及术后9个月内，研究人员测定了两组马循环类固醇激素（睾酮和雌二醇）浓度；同时定量检测了与骨和软骨代谢相关的分解代谢与合成代谢生物标志物，包括骨钙素N端中段片段（N-MID）、I型胶原交联C端肽（CTX-I）、II型胶原交联C端肽（CTX-II）、II型胶原羧基端前肽（CPII）、软骨寡聚基质蛋白（COMP）和透明质酸（HA）。此外，研究人员还检测了在代谢失调时上调的促炎标志物，包括前列腺素E2（PGE2）和白介素6（IL-6）。研究人员进一步探讨了性腺类固醇浓度与骨关节代谢生物标志物之间的潜在相关性。最后，为更全面地理解马的类固醇调控，研究人员还探究了类固醇生成的潜在性腺外来源。结果显示，去势未改变青春期后及成年马的骨关节代谢；尽管睾酮和雌二醇水平大幅下降，但两者在去势后仍可检测到，提示存在性腺外类固醇来源。这些发现表明骨与软骨的生长和稳态独立于性腺类固醇。
研究背景与问题
睾酮等睾丸类固醇激素在多种物种的骨骼生长、发育和维持中发挥核心作用，其通过调控多种骨细胞群的增殖、分化和凋亡而实现。青春期生长突增主要由性腺性类固醇分泌驱动，睾酮和雌二醇对骨骼生长尤其是青春期峰值骨量的获得至关重要：睾酮促进骨膜沉积从而导致骨径向生长，而青春期后期升高的雌激素水平通过作用于生长板软骨细胞诱导骨骺板闭合。成年期骨稳态依赖成骨细胞骨形成与破骨细胞骨吸收之间的精密平衡，而随年龄增长循环性类固醇激素水平下降会导致骨丢失并促进骨质疏松发生。临床与实验证据亦支持类固醇激素的关键作用：雌激素受体α（ERα）功能缺失的年轻男性骨骺不融合、性腺功能减退男性骨量丢失且骨折风险增加、雌激素受体1（Esr1）或雄激素受体（Ar）敲除雄性小鼠出现骨丢失。类固醇激素同样影响软骨生理，骨关节炎（OA）中基质分解代谢超过合成代谢，与II型胶原交联C端肽（CTX-II）升高相关；女性OA在绝经后显著增加，提示雌激素缺乏的作用；兔去势后两周内可见软骨细胞数量减少。
马在18至24月龄达到大部分成年体型，但骨骼成熟并未结束，四肢多数主要生长板在3至3.5岁之间闭合，且闭合时间受品种、性别、体型和整体发育影响。去势是马繁殖管理中常用的手术措施，用于去除性类固醇激素尤其是睾酮的主要来源。马是产生睾丸雌激素水平最高的雄性哺乳动物，但雌激素在马中的作用尚不清楚。尽管类固醇激素在人骨代谢和骨骼成熟中发挥作用，目前尚无稳健的流行病学证据表明性腺类固醇激素对马骨质疏松或骨关节炎有可测量的贡献。研究人员此前已研究早期去势与常规去势对马身体和行为发育以及骨关节代谢的影响，未发现早期去势的明显禁忌证。本研究旨在评估去势所致性腺类固醇剥夺对马骨关节代谢的影响，比较骨骼生长期（青春期后）去势与骨骼成熟后（成年期）去势的马，并探究类固醇生成的潜在性腺外来源。
研究方法
研究纳入两组异质性马匹，按去势时机分类并随访至术后9个月：成年期去势组为骨骼生长完成后去势的私人饲养马（各时间点n=6，去势平均年龄6.6岁[4.3-12.5]）；青春期后去势组为青春期后但仍处于骨骼生长期去势的私人饲养马（去势前n=9，3个月n=4，6个月n=8，9个月n=3，去势平均年龄2.2岁[2.0-2.3]）。动物来自法国「Centre Hospitalier vétérinaire équin de Livet」和「Centre de recherche de Tours」，于去势前及术后3、6、9个月采集血样。睾丸取自常规去势，肾上腺（n=5）和脂肪组织（n=4）取自未去势青春期后马的尸检（平均年龄21.5月龄[18-24]）。马软骨细胞（Cc）分离自2日龄健康幼驹关节软骨。主要关键技术方法包括：采用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量睾酮、17β-雌二醇及骨关节与炎症生物标志物；采用免疫组织化学定位睾丸与肾上腺的类固醇生成酶；采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测组织与软骨细胞中类固醇激素代谢酶的基因表达；采用Western-blot进行蛋白检测；统计分析采用Kruskal-Wallis检验联合Dunn多重比较、Mann-Whitney检验及Pearson相关系数。
研究结果
3.1 睾酮的循环水平与睾丸合成：去势前两组睾酮水平相近（成年马212.44 pg/mL ± 31.85，青春期后马170.57 pg/mL ± 32.37）。去势后3个月两组睾酮水平均显著下降约80%（分别为48.5 pg/mL ± 6.52和19 pg/mL ± 2.07）。值得注意的是，去势后9个月血液中睾酮仍可定量。成年期去势马在所有去势后时间点的睾酮水平均显著高于青春期后去势马。免疫组织学分析显示CYP17A1在两组睾丸间质组织中均有免疫定位，证实睾丸具备合成雄激素的能力。
3.2 雌二醇的循环水平与睾丸合成：与睾酮不同，去势前两组雌二醇水平存在差异，青春期后个体低于成年个体（137.73 pg/mL ± 21.62对994.62 pg/mL ± 181.77）。去势后3个月两组雌二醇水平均显著下降超过80%（分别为27.75 pg/mL ± 5.26和60.87 pg/mL ± 7.76），且两组在去势后3、6、9个月间无变化；但成年马在去势后3、6、9个月的雌二醇水平显著高于青春期后个体。芳香化酶（CYP19A1）仅定位于两组睾丸间质区，证实睾丸具备合成雌激素的能力。
3.3 骨关节与炎症标志物的循环水平：软骨合成标志物CPII与降解标志物CTX-II、骨合成标志物N-MID与降解标志物CTX-I在去势前及术后9个月内于两组中均相对稳定，仅成年马3个月时CPII显著下降。CTX-I水平在两组去势前后相近（去势前分别为0.23 ng/mL ± 0.09和0.23 ng/mL ± 0.03）。N-MID在青春期后马整个分析期间均可检出（平均水平5.34 ng/mL），而成年马去势前检测不到，去势后9个月开始可检出。去势前青春期后马（骨骼生长尚未完成）CTX-II水平总体高于成年马（成年马21.86 pg/mL ± 9.54，青春期后马61.76 pg/mL ± 12.92）。成年马仅在去势后3和6个月CPII水平低于青春期后个体（3个月时分别为1976.18 ng/mL ± 285.26和3179.85 ng/mL ± 285.64）。骨关节炎标志物COMP在两组整个分析期间保持稳定且不受去势影响，但去势后6和9个月青春期后马COMP水平高于成年马（6个月时分别为69.39 ng/mL ± 6.05和40.58 ng/mL ± 7.31）。HA水平在两组去势后均无变化，组间亦无差异（平均水平37.79 ng/mL）。炎症标志物PGE2和IL-6在去势后无变化（PGE2平均水平443.93 pg/mL），但去势前青春期后马IL-6水平显著高于成年马（109.7 pg/mL ± 13.04对49.08 pg/mL ± 20.72）。
3.4 骨关节与性腺标志物水平演变的相关性：无论哪一组，各性腺与骨关节标志物之间均未观察到正相关或负相关，仅雌二醇与PGE2水平在成年个体中存在正相关。这提示成年马骨关节代谢独立于类固醇影响。
3.5 性腺外类固醇激素来源的鉴定：在马肾上腺中检测到StAR、CYP11A1、CYP17A1、3β-HSD的基因表达，17β-HSD仅在一份肾上腺样本中检出。免疫组化将StAR、CYP11A1、CYP17A1和3β-HSD定位于肾上腺皮质，而17β-HSD和CYP19A1未被免疫检出。马脂肪组织中未检测到任何所研究基因的表达，免疫定位和Western-blot亦未显示任何类固醇生成酶蛋白表达。此外，马软骨细胞中检测到StAR、CYP17A1和17β-HSD的基因表达。
讨论与结论
本研究属于探究去势对马骨与软骨代谢影响的更广泛研究项目，此前工作聚焦于出生时或18月龄青春期前去势的马。本研究发现去势使循环睾酮下降80%，证实睾丸是马雄激素的主要来源，但降幅小于预期（人类约95%睾酮由间质细胞产生）；去势前两组睾酮无显著差异，尽管睾酮是雌二醇合成前体，血浆睾酮与雌二醇水平未见平行关系；去势前青春期后马雌二醇显著低于成年马，去势使两组雌二醇下降超过80%，证实睾丸是马雌二醇合成的主要来源，并提示雌二醇水平升高是成熟睾丸的特征，与既往未在3日龄马睾丸中检出芳香化酶而成熟睾丸表达该酶的结果一致，芳香化酶蛋白表达随年龄增加，因此去势年龄不同可能对雌二醇调控的生理功能产生不同影响。
尽管去势后性类固醇水平下降，但无论去势年龄如何仍可测得，此前研究亦观察到出生时或18月龄去势马睾酮和雌二醇水平升高。睾酮生成需要完整类固醇生成途径，而雌二醇合成仅依赖芳香化酶表达，故分布可能更广（人类睾丸合成仅占循环雌二醇的20%）。研究显示脂肪组织不参与去势后马血液中雌二醇和睾酮的合成，因未检测到类固醇生成酶。肾上腺雄激素占全部雄激素比例较小；本研究通过免疫组化证实马肾上腺皮质表达StAR、CYP11A1、CYP17A1和3β-HSD蛋白，与基因表达结果一致（17β-hsd除外，仅一份样本检出），故该组织可能合成睾酮，也可能合成雄烯二酮，其他外周组织可能完成后续步骤。此前质谱分析显示去势后硫酸化雌酮水平升高，雌酮-3-硫酸盐（E1S）是雌激素的潜在前体，可经硫酸酯酶（STS）脱结合为活性雌酮（E1），再经17β-HSD超家族还原为E2；本研究中硫酸酯酶基因表达在肾上腺、肝、肌肉、大肠和软骨细胞等多种马组织中检出，故肾上腺皮质或肝等外周组织在芳香化由其他组织完成的前提下能够合成雌激素；但本研究的肾上腺来自未去势马，而该物种去势后肾上腺CYP19A1表达增加已被证实，故不能排除去势后肾上腺芳香化酶活性增加。
研究报告了青春期后与成年马骨关节生物标志物代谢的不同特征：N-MID在青春期后马显著高于成年马而CTX-I无差异，提示青春期后马骨形成，与幼驹所见一致；CTX-II在去势前青春期后马（平均2.2岁即26月龄）显著高于成年马（平均6.6岁），并似逐渐下降至成年马水平，与既往幼驹队列从出生至33个月观察到的下降趋势相符（33个月时平均水平51.3 pg/mL），可能与青春期后马生长板发育结束及CPII水平稳定有关；去势后6和9个月青春期后马COMP高于成年马，COMP是OA软骨破坏相关的软骨转换标志物，但多种组织可贡献血清COMP水平，可解释两组差异（COMP还与其他疾病如恶性肿瘤、心血管疾病和组织纤维化相关）。
去势后残留的类固醇水平似乎足以维持骨代谢，这解释了标志物间无相关性。研究证明无论去势在骨骼生长期间还是成熟阶段进行，均不影响骨与软骨代谢，循环睾酮和雌二醇下降不改变提示骨与软骨完整性的生物标志物；但骨完整性仅被间接探究，双能X线吸收法（DXA）或microCT评估骨密度可提供进一步证据。性腺与骨软骨标志物间无相关性支持骨与软骨生长和维持独立于性腺类固醇，与既往早期去势不破坏骨与软骨稳态的结果一致；而人类和兔等物种报道的睾丸与骨关节组织间关系与本研究的原始数据相矛盾。研究结论为：去势对马骨关节代谢无影响，无论施于青春期后还是成年个体；尽管睾酮和雌二醇水平急剧下降，但无论去势年龄如何仍可测得，促使研究人员表征了马性腺外类固醇激素来源；由此导致的睾酮和雌二醇下降不影响与生长和骨软骨代谢相关的标志物水平；这些发现凸显骨与软骨生长和稳态独立于性腺类固醇，支持研究人员此前在青春期前马中获得的数据。尽管样本量小（n=6），结果与既往工作一致并支持之，既往在长期随访的新生幼驹较大队列中亦得出类似观察。因此，去势无论施于出生时、骨骼生长前、期间或之后，均不影响马的骨软骨代谢；且既往研究观察到出生时早期去势与较晚去势相比手术侵入性更小、无术后并发症、恢复快，且无明显干扰形态或行为发育。
