基于MMseqs2聚类分析的细菌蛋白质组早期终止转录本与缺失蛋白的人工伪迹鉴定

《NAR Genomics and Bioinformatics》：Early terminated transcripts and missing proteins reflect artifacts in bacterial proteomes

　　

许多细菌蛋白质组的高度冗余性可用于评估蛋白质组质量并识别序列错误。研究人员采用MMseqs2聚类并结合后续过滤，构建了包含至少50%聚类蛋白质组序列的簇，从而建立核心蛋白质集合，这些蛋白质存在于95%的聚类细菌中。这些簇通常捕获了细菌中超过80%的蛋白质。由于这些簇具有高度统一的长度（中位簇中超过99%的蛋白质处于众数长度），因此短于众数长度75%或长于133%的蛋白质很可能是伪迹。大多数“异常”蛋白质出现在不到10%的簇中，而“高异常”簇过度集中于少数蛋白质组中，这些蛋白质组通常具有较差的蛋白质组BUSCO片段评分。短异常蛋白质属于伪迹；至少80%的短异常基因组中包含该蛋白质的众数长度拷贝，这些拷贝因移码突变、终止密码子或起始密码子选择错误而被遗漏。采用50%参与率的MMseqs2聚类可提供稳健的细菌核心蛋白质集合，并能用于识别低质量的蛋白质组和蛋白质。

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一、研究背景与科学问题

随着高通量测序技术的普及，细菌基因组的数量呈爆炸式增长，导致冗余细菌蛋白质组数据急剧膨胀。然而，大量基因组组装和注释过程中引入的测序错误、组装碎片化以及起始/终止密码子误判，会产生大量虚假蛋白质序列。这些伪迹不仅污染公共数据库（如UniProtKB和UniParc），还严重干扰泛基因组（pan-genome）分析、直系同源基因（ortholog）鉴定以及物种进化研究。现有质量评估工具如AntiFam虽能识别部分常见伪迹，但缺乏对由片段化或注释错误导致的长度异常蛋白的系统性检测方法。此外，传统质量指标如BUSCO（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs）完整性评分主要关注保守核心酶，难以全面反映蛋白质组整体质量。因此，亟需一种高效、可扩展的策略，利用冗余蛋白质组数据自动识别并剔除这些人工伪迹，提升细菌蛋白质组数据的生物学真实性。

二、研究方法概述

研究人员从UniParc数据库中下载了20种细菌物种的全部非排除蛋白质组，共计涵盖557至22001个蛋白质组不等。核心分析方法采用MMseqs2软件进行蛋白质序列聚类，参数设置为：序列一致性阈值90%（min-seq-id 0.9）、双向比对覆盖度50%（coverage 0.5）、VTML10替换矩阵。随后筛选出至少50%蛋白质组共同拥有的簇作为核心蛋白集合。异常蛋白定义为长度低于簇众数长度75%或高于133%的序列。为验证异常蛋白的伪迹性质，研究人员利用tfastx程序将众数长度蛋白与产生短异常蛋白的基因组DNA进行比对，允许跨越移码和终止密码子的比对；同时使用ssearch程序进行蛋白-蛋白比对以确定异常延伸方向。所有统计分析基于R语言ggplot2库完成，流程代码开源发布于GitHub。

三、研究结果

1. MMseqs2聚类识别细菌核心蛋白质组

研究发现，采用50%蛋白质组参与阈值的MMseqs2聚类产生的簇数量与各物种中位蛋白数高度吻合（例如大肠杆菌获得3927个簇，接近其K12菌株的4402个蛋白）。这些簇中超过99%的成员来自97%以上的蛋白质组，平均捕获85%以上的蛋白多样性。通过与Horesh等发表的泛基因组数据集比较，确认该聚类集与核心泛基因组蛋白具有约95%的一致性。

2. MMseqs2簇具有高度长度均一性

在所有20种细菌中，97.1%的簇内蛋白具有完全相同的众数长度。仅有不到5.5%的簇中少于60%的蛋白处于众数长度。即使放宽标准，75%的簇中仍有95%的蛋白保持众数长度，证实细菌直系同源蛋白的长度高度保守。

3. 部分簇含有大量异常蛋白

异常蛋白总体罕见（中位频率约0.1%），但集中在少数簇中：例如大肠杆菌中最差4%的簇贡献了50%的异常蛋白。97%的异常蛋白为短异常（<75%众数长度），仅3%为长异常（>133%众数长度）。不同物种间异常率差异显著，其中结核分枝杆菌和霍乱弧菌的异常比例最高。

4. 异常蛋白集中于少数低质量蛋白质组

异常蛋白分布极不均匀：一半的大肠杆菌蛋白质组仅有≤3个异常蛋白，而最差的蛋白质组则含有超过200个异常蛋白。异常频率与BUSCO片段评分呈强负相关（对数尺度下相关系数显著），但与BUSCO完整性和缺失评分的相关性较弱，表明异常含量提供了独立的蛋白质组质量度量。

5. 短异常蛋白基因组中存在全长编码序列

通过tfastx比对发现，约80%的产生短异常蛋白的基因组中实际存在能够编码众数长度蛋白的完整开放阅读框。其中约60%可通过单条重叠群（contig）实现全长比对，其余需多条重叠群拼接。进一步分析显示，约50%的短异常源于移码或提前终止密码子（测序错误），剩余主要由起始密码子误判导致（N端缺失占60%）。

6. 长异常蛋白亦可在模式长度基因组中找到对应区域

长异常蛋白更为罕见，但在产生模式长度蛋白的基因组中，超过80%同样存在可能编码长异常蛋白的基因组区域。不过这些长延伸序列往往包含连续未知氨基酸残基（XXXX）或跨基因融合现象，且与已知蛋白的同源性较低，表明它们并非体内真实存在的蛋白。

四、结论与讨论

本研究证明，利用MMseqs2对高度冗余的细菌蛋白质组进行聚类，结合50%蛋白质组参与阈值，能够高效构建稳健的核心蛋白集合。这些簇内蛋白长度的极端均一性使得长度异常成为识别伪迹的可靠指标。研究人员得出结论：绝大多数长度异常蛋白（尤其是短异常）是由基因组碎片化、测序错误（移码/终止密码子）或注释错误（起始密码子误选）导致的人工伪迹，而非真实的生物学变异。长异常蛋白则多源于相邻基因的错误融合。异常含量可作为独立于BUSCO的蛋白质组质量补充指标，尤其适用于识别那些BUSCO评分看似正常但实际含有大量伪迹的蛋白质组。该策略为大规模细菌蛋白质组质量控制提供了自动化解决方案，有助于提升泛基因组分析和进化研究的准确性。