皱叶酸模提取物及其活性成分大黄素抗人冠状病毒OC43的活性研究

《PLOS One》：Antiviral activity of Rumex crispus extract and its bioactive constituent emodin against human coronavirus OC43

　　

冠状病毒可引起从轻度呼吸道症状到COVID-19等严重感染在内的多种疾病。尽管已有疫苗和治疗药物可用，但新变异株和耐药株的出现凸显了对额外抗病毒策略的需求。本研究将皱叶酸模（Rumex crispus）作为潜在抗病毒化合物的来源进行了考察。研究人员制备了皱叶酸模根部的乙醇（EtOH）提取物，并依次将其分离为正己烷（n-hex）、乙酸乙酯（EA）和水相组分。其中，正己烷和乙酸乙酯组分通过蛋白质印迹法（Western blot）、定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和噬斑测定显示出显著的人冠状病毒OC43抗病毒活性。通过高效液相色谱（HPLC）对提取物进行化学分析，鉴定出了表儿茶素、萘衍生物和蒽醌类化合物。值得注意的是，一种蒽醌类化合物——大黄素（emodin）表现出显著的抗病毒活性，并且发现其在具有活性的正己烷和乙酸乙酯组分中含量丰富。这些发现表明，大黄素可能有助于皱叶酸模提取物的抗病毒活性，但也不能排除其他生物活性成分的潜在参与。

研究背景与目的

冠状病毒是一类多样化的病毒，可引发从普通感冒到COVID-19等严重呼吸系统疾病的广泛病症。除了导致近期COVID-19大流行的SARS-CoV-2外，人冠状病毒OC43（HCoV-OC43）也因其属于β冠状病毒属而备受关注，该属同样包括SARS-CoV-2和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）。由于HCoV-OC43与高致病性冠状病毒的系统发育关系密切，但其自身致病性相对较低，因此常被用作初步筛选和评估潜在抗病毒药物的替代模型。尽管已有针对冠状病毒的疫苗和抗病毒药物，但新变异株和耐药株的持续出现，使得寻找具有不同作用机制的额外抗病毒策略仍十分必要。植物化学物质已被证明可通过多种途径抑制冠状病毒感染。皱叶酸模（Rumex crispus L.）俗称“卷叶酸模”，其提取物含有包括蒽醌类在内的多种生物活性化合物，据报道具有抗炎、抗氧化和抗癌活性。虽然大黄素此前已被报道具有抗冠状病毒活性，但皱叶酸模根部提取物及其组分的抗病毒潜力尚不明确。因此，本研究旨在评估皱叶酸模根部提取物及其溶剂组分对HCoV-OC43的抗病毒活性，并通过植物化学分析鉴定与观察到的抗病毒活性相关的生物活性成分。

研究方法概述

研究人员采用乙醇（EtOH）提取、液-液萃取分相（正己烷、乙酸乙酯、水相）、硅胶柱层析及C-18反相柱层析等技术，从皱叶酸模根部（购自韩国传统草药店，经J.H. Kim博士鉴定）分离纯化单体化合物。利用核磁共振波谱（NMR）和高效液相色谱（HPLC）进行结构鉴定与化学成分分析。抗病毒活性评价方面，以横纹肌肉瘤（RD）细胞为宿主细胞，通过蛋白质印迹法（Western blot）、定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和噬斑形成实验检测对HCoV-OC43复制的影响。细胞活力通过MTT法评估，病毒颗粒形态则通过扫描电子显微镜（SEM）观察。

研究结果

1. 皱叶酸模提取物抑制冠状病毒蛋白的表达

研究人员发现皱叶酸模提取物具有抑制冠状病毒复制的潜力。在感染HCoV-OC43的RD细胞中，分别以25和50 μg/mL的浓度处理乙醇总提物、水相、正己烷和乙酸乙酯组分。结果显示，正己烷和乙酸乙酯组分对冠状病毒蛋白表达表现出强烈的抑制作用，且呈剂量依赖性。通过计算半数抑制浓度（IC₅₀）发现，乙酸乙酯组分的IC₅₀低于正己烷组分，表明其抑制活性更强。

2. 皱叶酸模提取物减轻冠状病毒诱导的细胞毒性

MTT实验表明，皱叶酸模的正己烷和乙酸乙酯组分在高达80 μg/mL的浓度下不影响细胞活力。同时，冠状病毒感染使细胞活力降低约50%，而这两种组分的处理能够显著减轻冠状病毒诱导的细胞毒性，并在显微镜下观察到细胞病变减少。

3. 皱叶酸模提取物处理抑制冠状病毒的复制

qRT-PCR分析显示，皱叶酸模提取物处理降低了细胞和细胞培养上清液中基于RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）基因的冠状病毒RNA水平。噬斑形成实验表明，提取物处理导致病毒噬斑数量急剧减少。扫描电子显微镜（SEM）观察进一步证实，提取物处理减少了受感染细胞表面聚集的冠状病毒颗粒，在40 μg/mL浓度下几乎观察不到病毒粒子。

4. 从皱叶酸模提取物中分离单体化合物

通过HPLC分析，研究人员从正己烷和乙酸乙酯组分中分离出13个单体化合物，包括2个表儿茶素衍生物（1, 2）、5个萘衍生物（3, 4, 5, 8, 11）和6个蒽醌衍生物（6, 7, 9, 10, 12, 13）。对这些化合物进行抗病毒活性筛选后，发现大黄素（12）是病毒蛋白表达的强效抑制剂。此外，大黄素的结构类似物柠檬黄素（9）也显示出一定抑制活性，但其丰度低且活性弱于大黄素。进一步研究表明，大黄素以剂量依赖方式抑制冠状病毒蛋白表达，其在细胞培养上清液和细胞裂解液中的IC₅₀分别为1.655 μM和2.500 μM，远低于粗提物。同时，高达20 μM的大黄素对细胞活力无显著影响。

讨论与结论

讨论部分指出，蒽醌类化合物（如大黄素、大黄酸和芦荟大黄素）被认为是治疗SARS-CoV-2的候选化合物。已有报道称大黄素可以阻断SARS-CoV和HCoV-OC43的开放阅读框3a离子通道。本研究从皱叶酸模根部鉴定了13个化合物，并发现大黄素这一主要蒽醌类成分能够抑制冠状病毒复制。研究证实，大黄素富集于具有抗病毒活性的乙酸乙酯和正己烷组分中，而在水相组分中含量极低，这与各组分的抗病毒活性强弱一致。研究结论认为，皱叶酸模根部提取物展现出抗人冠状病毒活性，其中生物活性蒽醌大黄素可能与其他活性成分共同发挥作用。大黄素有望成为开发新型抗冠状病毒药物的先导化合物，对其结构修饰可能产生更有效的衍生物，未来需要包括体内动物实验在内的进一步研究来评估其治疗潜力。本研究的创新之处在于首次证明了皱叶酸模根部组分对HCoV-OC43的抗病毒活性，并通过植物化学分析确定了大黄素是与该活性相关的生物活性成分之一。尽管不能排除其他成分及潜在的协同效应，但这些发现为探索植物源抗冠状病毒药物提供了新的证据和基础。