《Current Research in Parasitology & Vector-Borne Diseases》：Nemabiome metabarcoding reveals strongyle communities and taxonomic overlap between domestic and wild bovids in Thailand
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胃肠道蠕虫是家养和野生反刍动物的常见寄生虫，可影响宿主健康和生产力。在家畜中，胃肠道线虫通过降低生长速度、繁殖性能和生产效率造成经济损失（Charlier et al., 2014）。在野生反刍动物中，寄生虫感染还可能影响体况、存活率和繁殖性能，对种群健康和保
胃肠道蠕虫是家养和野生反刍动物的常见寄生虫，可影响宿主健康和生产力。在家畜中，胃肠道线虫通过降低生长速度、繁殖性能和生产效率造成经济损失（Charlier et al., 2014）。在野生反刍动物中，寄生虫感染还可能影响体况、存活率和繁殖性能，对种群健康和保护具有潜在影响（Titcomb et al., 2022）。野生动物与家畜之间的相互作用可为跨宿主物种的寄生虫暴露创造机会，尤其是在共享放牧区域、水源或栖息地边缘的情况下（Barone et al., 2020; Babayani et al., 2022）。这对圆线虫尤为重要，因为许多物种具有直接生活史，感染阶段在环境中发育，随后在放牧过程中被获得，无需宿主物种之间的直接接触（Walker and Morgan, 2014）。对野生和家养有蹄类动物的分子研究已报道了共享的胃肠道线虫分类单元以及同域或共牧宿主之间寄生虫组成的差异（Beaumelle et al., 2022; Titcomb et al., 2022）。这些观察结果表明，重叠的环境可能为共享的环境暴露提供机会，而检测到的分类单元可能因宿主物种和当地环境而异。传统粪便检查仍是检测胃肠道蠕虫的重要方法，但圆线虫的形态学鉴定受到限制，因为许多物种的虫卵形态相似（Roeber et al., 2013）。因此，分子方法为表征圆线虫群落提供了额外的分辨率。基于内转录间隔区2（ITS2）区域高通量测序的Nemabiome宏条形码技术可鉴定混合寄生虫样本中的多个圆线虫分类单元，并已越来越多地应用于研究家畜和野生动物种群中圆线虫的分类组成和多样性（Avramenko et al., 2015, 2017; Beaumelle et al., 2022; Titcomb et al., 2022）。在泰国，牛和水牛通常饲养在保护区周边的农村社区，在森林边缘和邻近农业景观沿线形成潜在的野生动物-家畜交界，家畜可能与野生动物共享空间和自然资源（Horpiencharoen et al., 2025）。在泰国，爪哇野牛（Bos javanicus）和印度野牛（Bos gaurus）分别被国家列为濒危和易危，突显了这些野生牛科动物种群的保护重要性（Office of Natural Resources and Environmental Policy and Planning, 2025）。爪哇野牛和印度野牛栖息于保护林中，但也可能利用森林边缘和人类改造区域，从而与家畜利用区域产生空间重叠的机会（Prayoon et al., 2021; Chaiyarat et al., 2023）。这种重叠可能通过共享的放牧区域、水源和栖息地边缘为间接寄生虫暴露和传播创造机会（Barone et al., 2020; Babayani et al., 2022）。泰国的空间分析已识别出高牛密度与野生牛科动物适宜栖息地重叠的区域，特别是在森林边缘和保护区边界沿线（Horpiencharoen et al., 2025）。尽管泰国已报道家畜和野生爪哇野牛存在胃肠道蠕虫（Income et al., 2021; Watwiengkam et al., 2024），但关于自由放养爪哇野牛和印度野牛中圆线虫分类组成的信息，特别是与多个野生动物-家畜交界区域家养牛科动物的关系，仍然有限。因此，本研究旨在确定泰国牛、水牛、爪哇野牛和印度野牛中胃肠道蠕虫的发生情况，并利用ITS2 Nemabiome宏条形码技术表征圆线虫的分类组成。研究人员进一步检查了野生动物-家畜交界区域内家养和野生宿主库之间的地理分类学重叠，并评估了牛和水牛中圆线虫检测与管理相关因素之间的关联。通过将传统寄生虫学检查与分子表征相结合，本研究为泰国的寄生虫监测、野生动物健康监测以及野生动物-家畜交界处寄生虫发生和潜在跨宿主传播的进一步研究提供了基线信息。
**研究背景与意义**
胃肠道蠕虫是家养和野生反刍动物的常见寄生虫，可影响宿主健康和生产力。在家畜中，胃肠道线虫通过降低生长速度、繁殖性能和生产效率造成经济损失；在野生反刍动物中，寄生虫感染还可能影响体况、存活率和繁殖性能，对种群健康和保护具有潜在影响。野生动物与家畜之间的相互作用可为跨宿主物种的寄生虫暴露创造机会，尤其是在共享放牧区域、水源或栖息地边缘的情况下。这对圆线虫尤为重要，因为许多物种具有直接生活史，感染阶段在环境中发育，随后在放牧过程中被获得，无需宿主物种之间的直接接触。传统粪便检查仍是检测胃肠道蠕虫的重要方法，但圆线虫的形态学鉴定受到限制，因为许多物种的虫卵形态相似。基于内转录间隔区2（ITS2）区域高通量测序的Nemabiome宏条形码技术可鉴定混合寄生虫样本中的多个圆线虫分类单元，已越来越多地应用于研究家畜和野生动物种群中圆线虫的分类组成和多样性。
在泰国，牛和水牛通常饲养在保护区周边的农村社区，在森林边缘和邻近农业景观沿线形成潜在的野生动物-家畜交界。爪哇野牛（Bos javanicus）和印度野牛（Bos gaurus）分别被列为濒危和易危，栖息于保护林中，但也可能利用森林边缘和人类改造区域，与家畜利用区域产生空间重叠。尽管泰国已报道家畜和野生爪哇野牛存在胃肠道蠕虫，但关于自由放养爪哇野牛和印度野牛中圆线虫分类组成的信息，特别是与多个野生动物-家畜交界区域家养牛科动物的关系，仍然有限。因此，本研究旨在确定泰国牛、水牛、爪哇野牛和印度野牛中胃肠道蠕虫的发生情况，并利用ITS2 Nemabiome宏条形码技术表征圆线虫的分类组成，进一步检查野生动物-家畜交界区域内家养和野生宿主库之间的地理分类学重叠，并评估牛和水牛中圆线虫检测与管理相关因素之间的关联。
**主要技术方法**
研究人员于2025年1月至12月在泰国17个研究点采集了870份粪便样本，包括牛（n=353，来自62个牛群）、水牛（n=176，来自34个水牛群）、爪哇野牛（n=202，来自10个保护区）和印度野牛（n=139，来自10个保护区）。研究采用浮聚法、福尔马林-乙酸乙酯沉淀法和McMaster虫卵计数技术进行寄生虫学检查。根据McMaster虫卵计数结果，从每个宿主相关采样组中选取最多4份圆线虫阳性且EPG值最高的粪便样本进行分子分析，共选取126份样本，按36个宿主相关采样组进行DNA池化。采用QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit提取基因组DNA，使用NC1/NC2引物扩增圆线虫ITS2区域，通过Illumina MiSeq i100平台进行靶向扩增子测序。生物信息学分析采用DADA2流程进行序列处理和ASV推断，基于Nemabiome ITS2参考数据库进行分类学分配。统计分析采用IBM SPSS Statistics v.30，使用混合效应逻辑回归评估管理因素与圆线虫检测之间的关联。
**研究结果**
**胃肠道寄生虫的显微镜检查**：研究对870份牛科动物粪便样本进行了定性和定量显微镜检查。结果显示，胃肠道蠕虫总感染率在印度野牛中最高（91.4%），其次为爪哇野牛（89.1%）、牛（80.2%）和水牛（47.7%），各宿主物种间差异显著（P<0.001）。圆线虫型线虫是所有宿主中最常检测到的蠕虫类群（P<0.001），其感染率在印度野牛（86.3%）和爪哇野牛（83.2%）中最高，其次为牛（73.9%），水牛最低（23.9%）。Nematodirus spp.、Strongyloides spp.、Trichuris spp.、Moniezia spp.、Fasciola spp.和Paramphistomum spp.在各宿主物种间也存在显著差异（P≤0.005）。McMaster虫卵计数显示，圆线虫虫卵在牛（47.0%）、水牛（7.4%）、爪哇野牛（51.0%）和印度野牛（56.1%）样本中被检测到。牛的平均EPG为364.5±371.7，水牛为192.3±170.6，爪哇野牛为300.0±295.1，印度野牛为323.1±381.4。
**Nemabiome测序与圆线虫分类组成**：在36个池化DNA组中，34个（94.4%）成功扩增并纳入Nemabiome测序，包括12个牛池、2个水牛池、10个爪哇野牛池和10个印度野牛池。共获得3,674,345条原始序列，质控后保留3,605,379条，配对合并和嵌合体去除后剩余2,639,792条。最终非嵌合体序列数中位数为每池75,039条（范围：47,491–120,315条），共鉴定出714个独特ASV。分类学分配鉴定出属于7个属的15个圆线虫分类单元。Cooperia spatulata拥有最多的ASV数（n=286），其次为Cooperia pectinata（n=64）、Trichostrongylus axei（n=59）、Haemonchus similis（n=29）、Haemonchus contortus（n=22）、Mecistocirrus digitatus（n=19）和Oesophagostomum radiatum（n=19）。在所有池化DNA文库中，C. spatulata占最终非嵌合体序列 reads 的比例最大（42.03%），其次为O. radiatum（11.71%）、T. axei（8.53%）、C. pectinata（7.48%）、H. similis（6.78%）和H. contortus（4.02%）。在池水平上，C. spatulata是最常检测到的分类单元，出现在34个池化DNA文库中的33个（97.1%），在全部四种宿主中均被检测到，并在牛（29.98%）、爪哇野牛（49.80%）和印度野牛（61.13%）中显示最高的平均相对序列丰度。相比之下，H. contortus在两个水牛池中显示最高的平均相对序列丰度（67.84%），而C. spatulata仅占0.10%。
**野生动物-家畜交界处的圆线虫分类组成**：七个地理采样区域（OM、MHH、SLP、LP、KBR、KK和KS）具有来自家养和野生宿主的池化DNA文库。C. spatulata在全部七个交界区域的家养和野生池化DNA文库中均被检测到，显示最广泛的分类学重叠。T. axei在五个区域（OM、MHH、SLP、LP和KBR）的两个宿主组中均被检测到，H. similis在三个区域（MHH、SLP和KBR）的两个宿主组中均被检测到。其他分类单元的重叠更为局限；Bunostomum phlebotomum、C. pectinata、C. punctata、M. digitatus和O. radiatum各仅在1–2个交界区域的两个宿主组中被检测到。部分分类单元在个别交界区域内仅在一个宿主组中被检测到：H. contortus仅在MHH、SLP和KBR的家养池中被检测到，H. placei仅在SLP和KBR的家养池中被检测到，T. colubriformis仅在SLP的一个家养池中被检测到。在SLP内，B. phlebotomum、O. asperum、O. bifurcum和Spiculopteragia houdemeri仅在野生池中被检测到。同一交界区域内个体池化DNA文库间的分类组成也存在变异。池水平α多样性谱在交界区域和池化DNA文库间存在差异。在MHH中，家养池的平均观测ASV丰富度为52.8，野生池为41.3；Shannon指数均值分别为2.53和1.90，Simpson指数均值分别为0.808和0.714。在SLP中，家养和野生池的平均观测ASV丰富度分别为55.8和38.0，Shannon指数均值分别为2.60和1.67，Simpson指数均值分别为0.858和0.593。
**农场管理因素与家畜圆线虫检测的关联**：分析纳入来自52个牛群的306头牛和来自34个水牛群的176头水牛。在牛中，圆线虫检测与牛群规模（P=0.435）、饲养管理系统（P=0.281）或驱虫实践（P=0.158）之间未检测到统计学显著关联。尽管接受不定期或选择性驱虫的牛比无驱虫史的牛圆线虫检测 odds 更低（aOR=0.20，95% CI：0.045–0.886，P=0.034），但驱虫实践的总体效应无统计学显著性。在水牛中，圆线虫检测与牛群规模（P=0.584）、饲养管理系统（P=0.813）或驱虫实践（P=0.439）之间未检测到显著总体关联。在>100头规模的牛群类别中未检测到圆线虫阳性水牛（0/12），导致该组类别特异性估计不稳定。
**讨论与结论**
本研究调查了泰国牛、水牛、爪哇野牛和印度野牛的胃肠道蠕虫及圆线虫组成。胃肠道蠕虫在所有四种宿主中均被检测到，圆线虫型线虫是最常检测到的蠕虫类群。Nemabiome测序鉴定出属于7个属的15个圆线虫分类单元，并显示宿主物种和个体池化DNA文库间分类组成的变异。在野生动物-家畜交界区域内还观察到家养和野生宿主池之间的分类学重叠，而部分分类单元在特定区域内仅在一个宿主组中被检测到。
圆线虫型虫卵通常无法通过传统粪便显微镜可靠区分到属或种水平，因为其形态相似，限制了仅基于粪检的分类学解释。因此，ITS2 Nemabiome测序为所选池化样本中的圆线虫提供了额外的分类学分辨率。在鉴定的分类单元中，C. spatulata占序列 reads 的比例最大，并在34个成功测序的池化DNA文库中的33个中被检测到，在牛、爪哇野牛和印度野牛中显示最高的平均相对序列丰度。其他代表性分类单元包括O. radiatum、T. axei、C. pectinata、H. similis和H. contortus。Cooperia spp.、Haemonchus spp.、Oesophagostomum spp.和Trichostrongylus spp.的出现与泰国反刍动物先前的分子和寄生虫学研究一致。Mecistocirrus digitatus也在牛、爪哇野牛和印度野牛池中被检测到，在印度野牛中观察到最高的平均相对序列丰度（4.03%）。约15.4%的最终序列 reads 仍未分配，这可能反映当前参考数据库中代表性不完整或分类学分辨率不足。
在水牛中，H. contortus显示最高的平均相对序列丰度。由于水牛仅在三个区域通过浮聚法检测到圆线虫阳性样本，所有三个相应池化DNA组均进行ITS2 PCR扩增，其中两个成功扩增并纳入Nemabiome测序，因此水牛Nemabiome图谱应谨慎解释。
在七个野生动物-家畜交界区域内，C. spatulata在全部区域的家养和野生宿主池中均被检测到，而T. axei和H. similis分别在五个和三个区域的两个宿主组中被检测到。其他分类单元仅在1–2个交界区域的两个宿主组中被检测到。类似的胃肠道线虫分类学重叠已在其他野生动物-家畜和混合放牧系统中报道。这种重叠在生物学上是合理的，因为圆线虫具有直接生活史，感染阶段在环境中发育，通过共享或重叠的放牧区域可供不同宿主物种利用，无需宿主间直接接触。放牧管理可影响家畜对环境寄生虫阶段的暴露。因此，跨宿主暴露的机会可能因家畜管理系统而异。在泰国，生态学研究进一步支持间接野生动物-家畜接触的可能性。然而，分类学重叠本身不能证明传播发生或指示其方向。记录家养和野生牛科动物之间的分类学重叠为寄生虫监测提供了有用的基线信息，并可能有助于识别未来靶向调查的分类单元和交界区域。
部分圆线虫分类单元在特定野生动物-家畜交界区域内仅在家养或野生宿主池中被检测到。这些区域特异性检测应被视为所分析池化文库中的模式，而非该分类单元在另一宿主组中不存在的证据。同一交界区域内个体池化DNA文库间的变异也表明宿主组平均相对序列组成并未捕捉全部区域内变异。描述性α多样性谱在MHH和SLP的池化文库间也存在差异；然而，有限且不等的重复阻碍了正式统计比较，因此这些模式被描述性解释。
本研究中，显微镜检测到Nematodirus spp.虫卵，而Nemabiome测序未检测到该属。先前的Nemabiome研究已证明使用来自粪培养的第三期幼虫ITS2测序可检测Nematodirus spp.，而本研究使用直接从粪便材料提取的DNA。此外，测序样本基于圆线虫EPG选择并随后池化，而非专门针对Nematodirus spp.的存在进行选择。因此，目标材料、相对模板丰度、样本选择和池化的差异可能导致了这一差异。
管理相关因素分析未在牛或水牛中识别出圆线虫检测与牛群规模、饲养管理系统或驱虫实践之间的显著总体关联。尽管在类别水平上，来自不定期或选择性驱虫牛群的牛比无驱虫史的牛圆线虫检测调整 odds 更低，但驱虫实践的总体效应无统计学显著性，因此该个别估计应谨慎解释。几个类别的宽置信区间表明部分估计的精度有限，这些零发现应解释为未检测到关联，而非此类关联不存在的证据。
本研究使用来自每个宿主相关采样组中最多四份圆线虫阳性且EPG最高的样本的池化DNA进行Nemabiome测序。等体积DNA池化而未进行浓度归一化，可能导致样本间贡献不等。PCR扩增也可能引入分类单元特异性偏倚；因此，相对序列丰度应解释为半定量而非寄生虫丰度的直接测量。所得分子图谱代表所选池化样本，可能不完全反映低丰度分类单元或个体动物间的变异。家养和野生宿主之间的比较基于同一地理采样区域内的分类学重叠，因此提供共享分类学发生的证据而非直接寄生虫传播的证据。采样也未按季节分层，因此未专门评估寄生虫发生的潜在季节性变异。
本研究为泰国牛、水牛、爪哇野牛和印度野牛的胃肠道蠕虫发生和圆线虫组成提供了基线信息。胃肠道蠕虫在所有四种宿主中均被检测到，在爪哇野牛和印度野牛中感染率特别高，突显了野生牛科动物寄生虫监测的相关性。Nemabiome测序在成功测序的池化DNA文库中鉴定出代表7个属的15个圆线虫分类单元，其中C. spatulata在宿主物种中广泛检测到，并在全部七个野生动物-家畜交界区域的家养和野生宿主池中均被检测到。同一地理区域内共享圆线虫分类单元的出现与可能的共享环境暴露一致，并为靶向监测和进一步调查提供了有用的基线信息，尽管它不能证明直接寄生虫传播。在牛或水牛中，未识别出圆线虫检测与所评估的管理相关因素之间的显著总体关联。使用个体样本分子分析、更精细空间和时间采样以及种群遗传学方法的进一步研究将有助于阐明分类学重叠和可能的跨宿主传播模式，并支持泰国野生动物-家畜交界处的未来寄生虫监测。
