自然杀伤细胞对SOD1G93A肌萎缩侧索硬化症发病机制贡献有限：基于全面免疫表型分析和Ncr1与Properdin基因敲除的证据

《Brain, Behavior, & Immunity - Health》：Limited contribution of natural killer cells to SOD1G93A ALS pathogenesis: evidence from comprehensive immunophenotyping and genetic deletion of Ncr1 and Properdin

　　

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的、进行性致瘫的神经退行性疾病，累及运动皮层、脑干和脊髓中的运动神经元，诊断后中位生存期约为3年。ALS发病率约为2-3/10万人年，发病年龄在50至70岁之间。大多数ALS病例为散发性，约10%的患者具有家族史。铜锌超氧化物歧化酶（SOD1）基因突变是最早被鉴定的遗传病因之一，也是家族性ALS中最常见的突变之一。过表达SOD1突变的转基因小鼠表现出ALS病理和临床病程的关键特征，仍是理解潜在致病机制的重要模型。除运动神经元变性外，ALS还以明显的胶质细胞反应为特征，随着疾病进展胶质细胞获得有害功能。免疫反应近期也被认为是疾病进展的重要病理Contributor。调节性T细胞（Treg）在疾病早期增加，在进展期迅速下降，其抑制能力降低。过继转移Treg可延长ALS小鼠的生存期。研究人员和其他学者已证实CD8⁺T淋巴细胞在ALS患者和小鼠中浸润中枢神经系统（CNS）。表达SOD1突变的CD8⁺T细胞可选择性地杀伤推测处于电静息状态的运动神经元。清除CD8⁺T细胞可减少ALS小鼠的运动神经元丢失。自然杀伤（NK）淋巴细胞对ALS发病机制的贡献仍不明确。与CD8⁺T细胞不同，NK细胞的细胞毒性活性不依赖于主要组织相容性复合体（MHC）的抗原呈递。其活性取决于表达自身MHC I类分子（MHC-I）的细胞提供的抑制信号与转化细胞丢失MHC-I表达或表达其他刺激分子时提供的刺激信号之间的平衡。据报道，基于CD3、CD16和CD56表达，ALS患者外周血中NK细胞数量较健康个体增加。然而，也有报道称散发性ALS患者外周血中CD3^?CD56⁺细胞减少。尽管有报道称NK细胞数量与ALS功能评定量表（ALSFRS-R）呈负相关，但NK细胞变化与ALSFRS-R评分变化并无直接相关性。另一项研究记录到缓慢进展型ALS患者中CD56^brightCD16^dim NK细胞数量显著高于快速进展型ALS。在SOD1^G93A小鼠脊髓中已描述NK1.1⁺细胞显著增加。关于NK细胞在ALS发病机制中的功能，注射清除性抗NK1.1抗体对生存期无影响。相反，通过注射白细胞介素（IL）-2复合物增加SOD1^G93A小鼠脊髓中浸润性NKT和NK细胞数量对ALS小鼠寿命无影响。然而，另一项研究表明，在SOD1^G93A和TDP-43^A315T小鼠中注射清除性抗NK1.1可延迟疾病发作并延长小鼠寿命。后一项研究提出NK细胞在神经退行性背景下对运动神经元发挥细胞毒性活性。本研究旨在结合靶向自然细胞毒性触发受体（Ncr1）的遗传工具和不同的NK细胞标志物，追踪NK细胞并研究其在ALS发病机制中的细胞毒性作用。Ncr1（NKp46）与Ncr2（NKp44）和Ncr3（NKp30）属于同一家族，表达于NK细胞上，作为靶细胞表达的非MHC配体的活化受体。Ncr1激活触发NK细胞脱颗粒和细胞毒性，以及促炎细胞因子的产生，尤其是干扰素γ（IFNγ）。循环NK细胞的数量、成熟和活化状态在SOD1^G93A和野生型小鼠之间无差异，且与先前报道相反，未观察到NK细胞显著浸润CNS。表达SOD1^G93A的NK细胞在共培养中不影响运动神经元存活，Ncr1基因敲除对SOD1^G93A小鼠的疾病发作、运动功能下降、运动神经元存活或寿命均无影响。为进一步验证研究人员的发现，研究人员接下来研究了Properdin。Properdin（补体因子P）是一种可溶性血浆蛋白，被描述为补体活化的正调控因子，已被提出可作为NKp46的配体。研究人员显示Properdin修饰错误折叠的SOD1聚集体和退变星形胶质细胞，并可能作为小胶质细胞的吞噬信号。然而，在SOD1^G93A小鼠中靶向敲除Properdin基因既不影响神经炎症也不影响运动神经元存活。本研究不支持NK细胞在ALS小鼠疾病进展中发挥实质性贡献。

**研究背景与问题**

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，以运动皮层、脑干和脊髓中的运动神经元进行性丧失为特征。SOD1基因突变是最早鉴定的家族性ALS遗传病因之一，过表达SOD1突变的转基因小鼠（SOD1^G93A）仍是研究ALS致病机制的核心模型。近年来，免疫反应被认定为ALS疾病进展的重要病理Contributor，其中调节性T细胞（Treg）和CD8⁺T细胞的作用已有较为明确的研究证据。然而，自然杀伤（NK）细胞在ALS发病机制中的贡献长期以来存在争议。临床研究报道ALS患者外周血NK细胞数量变化不一致，有的报道增加，有的报道减少；动物模型研究中，NK细胞在SOD1^G93A小鼠脊髓中的浸润情况以及清除NK细胞对疾病进程的影响也存在相互矛盾的结论。部分研究提出NK细胞可能通过细胞毒性活性直接杀伤运动神经元，而另一些研究则未观察到NK细胞对疾病进程的显著影响。这种分歧可能源于方法学差异，包括NK细胞标志物的选择、抗体清除策略的特异性以及动物模型的不同。因此，研究人员旨在结合全面的免疫表型分析和靶向Ncr1（NKp46，NK细胞活化受体）及Properdin（NKp46配体）的遗传敲除策略，系统评估NK细胞对SOD1^G93AALS小鼠发病机制的贡献。

**主要技术方法**

研究人员利用Ncr1^gfp/gfp报告小鼠（将GFP插入Ncr1基因座并删除外显子5-7）与SOD1^G93A小鼠杂交，通过流式细胞术对血液和CNS中NK细胞的频率、成熟（CD49b/CD11b/KLRG1/CD27分期）和活化（CD69）状态进行免疫表型分析；采用免疫组化检测GFP⁺细胞在脊髓中的浸润；通过运动神经元-NK细胞体外共培养评估NK细胞对运动神经元存活的影响；利用Ncr1基因敲除评估对疾病发作、运动功能和寿命的影响；并构建Properdin基因敲除小鼠分析其在神经炎症和运动神经元存活中的作用。统计学采用t检验、Kruskal-Wallis检验、ANOVA及Kaplan-Meier生存分析。

**研究结果**

**循环NK细胞在ALS小鼠中频率、成熟和活化状态无异常**：通过流式细胞术分析140天龄（症状期）SOD1^G93A、Ncr1^gfp/gfp及SOD1^G93A;Ncr1^gfp/gfp小鼠外周血，发现Ncr1⁺NK1.1⁺、GFP⁺NK1.1⁺、Ncr1⁺CD49b⁺及GFP⁺CD49b⁺NK细胞频率在野生型与SOD1^G93A之间无显著差异。对150天龄小鼠循环淋巴细胞的meta分析亦未发现CD49b⁺NK细胞频率差异。通过CD49b/CD11b/KLRG1分期及CD27/NK1.1组合分析NK细胞成熟阶段，各基因型间无显著差异。CD69⁺活化NK细胞比例在各组间亦无差异。在110天龄疾病发作期，NK1.1⁺、CD11b⁺KLRG1^-NK1.1⁺和CD11b⁺KLRG1⁺NK1.1⁺细胞频率在野生型与SOD1^G93A之间无显著变化。这些结果表明ALS小鼠循环NK细胞在频率、成熟和活化方面均无显著异常。

**NK细胞未显著浸润SOD1^G93A小鼠CNS**：在90天（症状前）、110天（发作期）和140天（症状期）对Ncr1^gfp/gfp和SOD1^G93A;Ncr1^gfp/gfp小鼠脊髓切片进行GFP免疫标记，虽在脾脏中可检测到GFP⁺细胞，但脊髓中仅偶见GFP⁺细胞，未见显著浸润。流式细胞术分析110天龄小鼠CNS显示，Ncr1⁺NK1.1⁺和GFP⁺NK1.1⁺细胞频率在SOD1^G93A与对照之间无显著差异。值得注意的是，CD45⁺CD3^-NK1.1⁺细胞比例在野生型与SOD1^G93A之间无显著差异，但NKT细胞群体在140天龄SOD1^G93A小鼠脊髓中显著增加。进一步分析发现，在CD45^intCX3CR1⁺驻留小胶质细胞群体中，NK1.1⁺细胞比例在SOD1^G93A小鼠脊髓中显著增加，表明髓系细胞可在ALS脊髓中表达NK1.1。对150天龄小鼠CNS中CD49b⁺细胞的meta分析亦未显示显著差异。这些结果表明先前报道的NK细胞浸润信号可能部分来源于表达NK1.1的髓系细胞。

**Ncr1缺失不影响SOD1突变小鼠的运动功能下降或寿命**：研究人员评估了Ncr1功能缺失对SOD1突变小鼠疾病发作（以体重峰值时间定义）、运动功能（网格测试）和寿命的影响。SOD1^G93A与SOD1^G93A;Ncr1^gfp/gfp小鼠在疾病发作时间（113.7±2.9天 vs 121.8±4.1天，P=0.118）、运动功能下降和平均寿命（166.9±2.1天 vs 163.9±2.7天，P=0.566）方面均无显著差异。按性别分层分析亦未发现显著差异。对140天龄小鼠脊髓ChAT⁺运动神经元数量的分析显示，SOD1^G93A与SOD1^G93A;Ncr1^gfp/gfp之间无显著差异，而SOD1突变体单独表达导致运动神经元显著丢失。体外共培养实验表明，来自130天龄野生型或SOD1^G93A小鼠的NK细胞与胚胎运动神经元共培养48小时后，运动神经元存活率无显著变化。这些结果表明Ncr1缺失对ALS相关运动系统退化无功能性影响。

**Ncr1配体Properdin标记错误折叠SOD1包涵体和退变星形胶质细胞**：研究人员发现Properdin在症状期SOD1^G93A小鼠脊髓中显著积累。免疫组化显示Properdin修饰错误折叠SOD1沉积物，且这些结构可与CD45⁺细胞（具有大胞体和有限分支的 reactive 小胶质细胞形态）相关联。共聚焦显微镜3D重建显示CD45⁺细胞紧密包裹Properdin标记的结构。CD68（促进吞噬作用）存在于SOD1^G93A脊髓中Properdin修饰元件周围，CD68与Iba1共定位，提示Properdin可能作为吞噬信号。Properdin标记的结构大小约10 μm且DAPI染色阳性，提示其标记濒死细胞。Properdin不与ChAT⁺运动神经元共标记，但与呈现退变星形胶质细胞特征的细胞共标记，这些细胞呈球形、GFAP胞体染色模糊、近端突起GFAP染色致密，并表达cleaved caspase-3和泛素。这些结果表明Properdin可识别错误折叠SOD1聚集体和退变星形胶质细胞，可能作为小胶质细胞的吞噬信号。

**SOD1^G93A小鼠中Properdin靶向敲除**：研究人员将SOD1^G93A小鼠与Properdin基因敲除小鼠杂交，分析Properdin功能缺失对ALS相关神经炎症反应和运动神经元存活的影响。结果显示，SOD1^G93A小鼠症状期CD45⁺细胞数量显著增加，但在SOD1^G93A;Properdin^-/-小鼠脊髓中无变化。150天龄SOD1突变体小鼠GFAP⁺细胞显著增加，但Properdin敲除未改变脊髓腹角星形胶质细胞数量。GFAP⁺/cleaved caspase-3⁺退变星形胶质细胞数量亦不受Properdin敲除影响。虽然SOD1^G93A小鼠症状期脊髓运动神经元存活显著下降，但SOD1^G93A与SOD1^G93A;Properdin^-/-之间无差异。这些观察表明Properdin在ALS小鼠神经炎症反应和运动神经元存活中不发挥显著作用。

**讨论与结论**

在讨论部分，研究人员首先讨论了Ncr1（NKp46）表达细胞类型的多样性。Ncr1不仅表达于NK细胞，还表达于固有淋巴样细胞（ILC），包括Ncr1⁺ILC3、Vδ1⁺T细胞及肠道上皮内淋巴细胞。Ncr1⁺ILC3主要存在于黏膜表面、次级淋巴器官、脑膜和CNS，在实验性自身免疫性脑脊髓炎中通过调控CD4⁺Th17细胞浸润调节神经炎症。研究人员指出，本研究未能检测到脊髓实质中GFP⁺细胞，可能与GFP表达低于免疫组化检测阈值、CNS微环境中Ncr1转录活性下调、或脑膜区室需要特殊组织处理方法（如非传统脊髓挤出、纵切或全mount制备）等因素有关。因此不能排除Ncr1⁺ILC存在于脊髓脑膜而被常规冠状切片遗漏的可能性。其次，研究人员讨论了NK1.1在脊髓小胶质细胞、活化巨噬细胞和固有淋巴样细胞中的表达。SOD1^G93A小鼠脊髓小胶质细胞转录组分析将Klrb1c（编码NK1.1抗原）鉴定为症状早期与症状前阶段之间上调最显著的基因。在炎症条件下，巨噬细胞可表达NK1.1并获得穿孔素依赖性细胞毒性活性。肝脏中约60%的CD45⁺CD3^-NK1.1⁺细胞为经典CD49b⁺NK细胞，40%为驻留ILC1。CNS中ILC1表型为CD45^highCD3^?NK1.1⁺CD49a⁺CD49b^?，表达穿孔素和颗粒酶B，刺激后产生TNFα和IFNγ。本研究虽仔细组合了淋巴和髓系标志物以缩小与NK以外细胞类型的重叠，但未能证明显著NK浸润CNS或ALS小鼠循环血NK细胞数量变化。第三，关于ALS中NK细胞的外周扰动，本研究的免疫表型分析显示循环NK细胞的代表性和成熟/活化状态在ALS与对照小鼠之间无差异，与先前报道SOD1^G93A小鼠脾脏和肝脏NK细胞比例无差异一致。人类研究中NK细胞数量变化的差异可能与临床特征、队列大小和方法学因素有关，且CD56也表达于活化浆细胞样树突状细胞、IL-15诱导的髓系树突状细胞、ILC1样细胞和NKT细胞，因此免疫表型分析的标准化至关重要。第四，关于Properdin，研究人员指出Properdin主要作为替代补体途径的正调控因子和模式识别分子，识别并结合濒死细胞以促进补体活化和吞噬清除。在缺血性卒中中，Properdin水平升高促进小胶质细胞活化并增强炎性细胞因子产生。本研究观察到Properdin在ALS中也能识别错误折叠SOD1包涵体和退变星形胶质细胞，并可被脊髓中CD68⁺吞噬性小胶质细胞识别，可能作为调理素发挥作用。然而，Properdin缺失并未增加ALS小鼠脊髓运动神经元存活数量，这与另一种补体成分C1q在SOD1^G37R小鼠中敲除不影响神经炎症反应或运动神经元丢失的观察相平行。此外，C3缺失也不改变SOD1突变小鼠的疾病进程和运动神经元变性。虽然补体上游成分的失活似乎不发挥显著作用，但并不排除补体系统参与ALS发病机制，如终末成分C5的抑制可延长ALS小鼠寿命并改善运动功能。Properdin作为NCR1配体的缺失观察与Ncr1缺陷对病理发展和进展无影响的結果一致。

研究结论部分指出，本研究结果为NK细胞在ALS发病机制中的潜在参与提供了新见解。虽然先前研究提示NK细胞在疾病中发挥作用，包括其浸润CNS和可能的细胞毒性效应，但研究人员的 convergent 发现不支持这些细胞在SOD1^G93A小鼠模型中发挥主要致病作用。具体而言，研究人员观察到ALS与对照小鼠之间NK细胞数量、成熟或活化无显著差异，也未检测到CNS中显著的NK细胞浸润；结合Ncr1基因敲除对疾病发作、运动功能下降或生存期无影响，这些 convergent 发现不支持NK细胞在SOD1^G93A小鼠模型中发挥主要致病作用。尽管发现NKp46/Ncr1配体Properdin与错误折叠SOD1聚集体和退变星形胶质细胞相关联，但其缺失同样对神经炎症或运动神经元存活无影响。尽管如此，研究人员的发现仅限于单一转基因小鼠模型，未涉及脑膜区室或NK细胞以外的ILC亚群。未来需要在人类患者和补充模型系统中进一步研究以阐明NK细胞和其他ILC在ALS发病机制中的相关性。