分层支架的空间结构框架调控骨髓间充质干细胞（MSCs）/间充质细胞（SCs）的相互作用，以促进骨骼再生

《Biomaterials》：Spatial Bridges of Hierarchical Scaffolds Orchestrate MSCs/SCs interaction for Bone Regeneration

　　摘要
在三维微环境中，多个细胞及其与细胞外基质的时空分布和相互作用对调节细胞行为以及调控组织发育和再生起着关键作用。为组织工程中的多细胞交流准备分层结构支架具有重要意义。在这里，受到“喜鹊桥”这一概念的启发，我们提出了一种仿生分层多通道支架，作为一种“空间桥梁”来协调多细胞的时空相互作用，以促进有神经支配的骨骼再生。分层多通道结构有助于间充质干细胞（MSCs）和施万细胞（SCs）之间的相互迁移和能量代谢活动，从而增强它们的特异性分化。转录组分析显示，MSCs/SCs之间的交流是通过细胞因子-细胞因子受体相互作用介导的，包括激活多个与神经发生/骨形成相关的信号通路。在兔子骨缺损模型中，装载SCs的分层多通道支架构建了一个神经诱导的代谢激活微环境，与传统的生物陶瓷支架相比，在术后12周时，骨骼再生增加了3.24倍，神经血管网络重建增加了2.29倍。因此，本研究提出了一个独特的概念，即仿生分层支架可以作为“空间桥梁”，加速复杂组织和器官再生的多细胞时空相互作用，为设计下一代再生生物材料开辟了新的途径。

引言
自然组织依赖于多种组织驻留细胞和细胞外基质（ECM）成分在三维（3D）微环境中的协调分层组装，这些成分负责创建宏观组织结构并介导生理功能[1]。多细胞的时空分布和相互作用模式可以调节多细胞通信方式，从而影响细胞行为，包括增殖、迁移和分化[2][3][4]。然而，在大多数先前的研究中，细胞间交流的探究主要是通过直接二维（2D）共培养、条件培养基或Transwell室共培养模型来进行的，这些方法无法真实地再现天然的时空微环境[5]。最近，提出了多细胞组织工程的概念，旨在模拟自然的多细胞生态位。新兴技术如微流控芯片、3D打印和球体组装已被广泛用于控制多细胞的空间排列和探究细胞间通信[6][7][8]。得益于这些技术，工程化的构建物如人工皮肤、心脏组织和肝脏组织具有仿生细胞组成和分布，可以部分复制自然器官的结构[9][10][11]。尽管取得了这些令人鼓舞的成就，但这些构建物中的基本生物材料（如水凝胶和聚合物纤维）通常仅作为提供细胞附着和生长的支持基质。然而，它们的物理化学性质在调节细胞间交流中的关键作用被大大忽视了。因此，开发具有可调分层拓扑结构和生化特性的创新工程平台对于系统地探索多细胞相互作用是非常必要的，这可能会为设计用于复杂组织再生的仿生组织工程构建物提供启示。

正如前文所述，基于3D打印的策略被认为是一种有效的方法，用于构建具有特定定制宏观结构的三维仿生支架，以研究细胞间交流[12][13]。例如，张等人通过改变巨噬细胞和间充质干细胞（MSCs）的空间分布，制备了类似蜂窝状的支架，以研究骨免疫相互作用[14]。值得注意的是，多细胞空间分布的太极图案可以通过调节巨噬细胞朝向M2抗炎表型的极化，以及增强MSC的骨形成分化，建立一个有利的骨免疫微环境。基于组装/拆卸的模块化策略，余等人开发了一种模块化支架来研究多细胞相互作用，这可以精确阐明单个细胞类型在共培养系统中的具体贡献[15]。尽管有这些有趣的进展，当前主流的3D打印技术在创建数十微米尺度的三维物理拓扑结构方面仍存在困难，这与细胞大小相当。因此，空间拓扑对细胞间交流的影响仍然很大程度上未被探索。单向冷冻铸造作为一种有效的方法出现，可以通过调整反应参数（如冷冻温度、冷却速率和溶剂浓度）来精确调节孔结构[16]。通过单向冷冻制造的对齐结构支架已被广泛用于修复骨骼、骨骼肌、周围神经和脊髓[4][17][18][19][20]。因此，我们提出将3D打印与定向冷冻相结合，构建一种具有可控宏观和微观特征的分层结构生物陶瓷支架。具体来说，3D打印用于定义所需的宏观空腔/通道框架以提供结构支持和支持缺损匹配，而定向冷冻用于生成能够提供细胞指导信号的微米级拓扑特征。我们假设这种多尺度设计可以桥接组织尺度的结构要求和细胞尺度的生物指导信号，从而促进多个细胞的迁移和相互作用。

骨骼再生是一个动态的生物学过程，涉及骨形成、血管生成、免疫调节和神经发生的协调参与[21][22]。以往的研究主要集中在设计增强MSCs骨形成的生物材料、诱导血管化和重塑免疫微环境上，这些策略已经取得了合适的骨骼再生结果[23][24]。最近，基于神经调节的策略作为一种有前景的新范式出现，用于实现功能性骨骼再生[25]。通常，添加神经细胞、神经营养因子或神经来源的外泌体可以模拟神经微环境，以加速骨骼修复[26][27][28][29][30]。应该强调的是，这些研究仅仅探讨了神经通过释放神经因子（包括神经递质和神经营养因子）对骨骼的单向调节作用。实际上，骨骼和神经之间存在双向通信，而对骨骼对骨内神经的调节研究较少[31]。骨骼可以分泌生物活性信号因子并提供机械刺激来影响骨内神经的活动[32]。例如，成骨细胞分泌的前列腺素E2（PGE2）可以与感觉神经表面的受体4（EP4）结合，从而抑制交感神经活动[33]。此外，骨骼的微观结构特征（包括厚度、孔隙率和孔径）也影响神经的生长[34]。因此，探索神经和骨骼之间的双向相互作用对于设计骨骼再生生物材料并最终促进功能性骨骼再生具有重要意义。因此，可以合理假设分层结构支架可以作为空间桥梁，协调多细胞迁移/招募并增强它们的交流，从而加速复杂的神经支配骨骼再生。在骨骼再生过程中，骨髓间充质干细胞（BMSCs）被认为是一个代表性的骨形成干细胞群体，因为它们在骨骼再生中起着核心作用，并且对微尺度拓扑线索具有明显的敏感性。此外，施万细胞（SCs）作为参与周围神经修复的主要神经胶质细胞，不仅提供神经营养支持，还积极参与骨骼愈合[35]。研究表明，缺乏SCs的调节会导致骨骼干细胞的机能缺陷和骨骼愈合受损[36]。此外，受伤区域的SCs会显著增殖，并积极参与构建骨再生微环境[30]。总的来说，探索拓扑线索是否以及如何协调BMSCs和SCs之间的时空相互作用代表了模拟神经-骨骼交流的一种工程方法，可能会为复杂的骨骼再生带来新的见解。

在这项工作中，我们受到中国传统爱情神话“牛郎与织女”的启发，其中喜鹊建造空间桥梁帮助它们相遇和交流，通过结合3D打印和单向冷冻铸造技术，开发了仿生分层多通道支架，作为协调复杂神经支配骨骼再生多细胞时空分布和相互作用的多功能平台（图1）。首先，通过编程设计、原材料和加工参数，可以很容易地调整分层支架的生物物理（例如，宏观到微观结构）和生化（例如，生物活性离子释放）特性，使其满足不同的临床需求。具体来说，宏观空腔结构提供了适应骨骼再生需求的机械支持，而对齐的微通道网络作为仿生生态位，促进宿主细胞附着和渗透，同时从空腔结构释放的生物活性离子也刺激了细胞分化活动。其次，类似“空间桥梁”的分层多通道结构有效促进了MSCs和SCs之间的相互迁移和招募，从而增强了它们的通信并激活下游的神经-骨形成再生反应。mRNA测序分析进一步显示，分层架构介导的MSCs/SCs交流涉及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT、钙信号和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的激活，从而增强了它们各自的能量代谢水平和骨形成/神经发生分化活动。更重要的是，装载SCs的仿生分层支架可以为吸引内源性干细胞和调节骨形成分化提供神经诱导的代谢激活微环境，以及诱导神经发生和血管生成。在仿生分层支架中良好协调的骨形成/神经发生耦合有效地加速了复杂的神经支配骨骼再生，特别是在核心缺损区域促进了骨骼形成和神经支配。因此，用于协调细胞时空分布和相互作用的分层支架概念代表了一种有前景的方法，适用于大段骨骼修复和其他复杂组织/器官重建。

**生物仿生分层多通道支架的制备和表征**
如图1a所示，分层多通道支架是通过结合3D打印和单向冷冻铸造技术制备的。通过3D打印制备了具有对齐宏观通道结构的Akermanite（Ca2MgSi2O7，AKT）生物陶瓷支架，以提供机械支持（图S1）[37]。随后，将含有明胶甲基丙烯酰胺（GM）和化学交联剂（APS，TEMED）的前体溶液注入AKT支架中，然后转移到-196°C。

**讨论**
骨骼再生是一个精心协调的过程，涉及骨形成、神经发生、血管生成和免疫调节的精确协调。尽管神经发生对骨骼修复的重要性日益明显，但基于神经发生的骨骼再生方法尚未得到充分研究[59]。一些研究试图将神经活性成分（包括神经营养因子、神经递质和神经细胞来源的外泌体）纳入其中。

**结论**
总之，我们报道了一种仿生分层多通道支架，作为协调复杂组织再生多细胞时空相互作用的多功能平台。生物物理结构（对齐的宏观-微观多通道）和生化特性（生物活性离子释放）共同促进了BMSCs和SCs的渗透和分化。此外，分层多通道支架作为“空间桥梁”，显著促进了...

**作者贡献声明**
Chengtie Wu：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源获取，概念构思。
Jiang Chang：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源获取，概念构思。
Ziyi Zhao：撰写 – 审稿与编辑，原始草案编写，可视化，方法学，调查，数据管理，概念构思。
Jiyi Huang：方法学。
Zhibin Liao：方法学。

**数据可用性**
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**影响声明**
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**利益冲突声明**
作者确认与本出版物无关的任何已知利益冲突，并且本工作未获得可能影响其结果的任何重大财务支持。

**致谢**
本工作得到了中国国家重点研发计划（2023YFB3813000）、国家自然科学基金（32225028、32130062 和 32501166）、上海市科学技术委员会（24520750100）、上海航海计划（24YF2753500）以及中国博士后科学基金会（GZC20241821、2025T180796 和 2025M772941）的支持。

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