小说4-苯胺吡啶 N-酰腙衍生物作为双重EGFRWT/VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂用于治疗非小细胞肺癌：设计、合成、生物评估及计算研究

《Bioorganic Chemistry》：Novel 4-Anilinopyrimidine- N-Acylhydrazone derivatives as dual EGFRWT/VEGFR-2 tyrosine kinase inhibitors against non-small cell lung Cancer: Design, synthesis, biological evaluation, and computational studies

　　

• •
  设计的新颖嘧啶-酰腙杂化物可作为双重EGFR^WT/VEGFR-2抑制剂。
• •
  主要化合物9e表现出较强的A549细胞毒性（IC₅₀ = 1.25 μM）。
• •
  9e对癌细胞的选择性优于正常细胞（SI = 187.5）。
• •
  9e能显著抑制EGFR^WT（IC₅₀ = 0.074 μM）和VEGFR-2（0.055 μM）。
• •
  9e可诱导A549肺癌细胞发生凋亡，这一效应通过流式细胞术得到证实。

引言

受体酪氨酸激酶（RTKs）是控制细胞重要功能（如分裂、存活、迁移和抑制凋亡）的关键调控蛋白。当配体结合时，RTKs会催化磷酸基团从三磷酸腺苷（ATP）转移到其细胞内酪氨酸激酶结构域（TKD）上的特定酪氨酸残基上（自磷酸化）。这些磷酸化残基激活下游信号转导通路，例如JAK–STAT、PI3K–AKT和RAS–MAPK，从而调节多种细胞反应[1]。表皮生长因子受体（EGFR）和血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）是研究广泛的RTKs，在靶向药物开发中发挥着重要作用[2]。

EGFR属于ErbB/EGFR家族，它可以与多种配体结合，包括表皮生长因子（EGF），从而激活细胞增殖并抑制凋亡[3]。EGFR的失调（由于过度表达或激活突变）与许多人类癌症的发生机制有关，包括肺癌、乳腺癌、结肠癌和胰腺癌。2024年，肺癌估计造成了264万新病例和约190万死亡病例，仍然是全球癌症死亡的主要原因。非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌病例的80-85%， merupakan sebuah beban klinis dan kesehatan masyarakat yang besar[4]。NSCLC的快速肿瘤生长、肿瘤分化不良以及高转移率都与EGFR过度表达有关[5][6]。EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）能够竞争性地结合到TKD的ATP结合口袋，从而抑制致癌细胞生长信号所需的自磷酸化。第一代可逆TKIs，如吉非替尼和厄洛替尼（图1），在未经治疗的患者中可达60-80%的反应率，但不幸的是，由于T790M门控突变，在12-24个月内会产生耐药性。第二代和第三代抑制剂，如达克替尼和奥西替尼（图1），通过增强与T790M突变EGFR的结合和不可逆相互作用来克服这种类型的耐药性[7]。

从现有血管中形成新的血管（肿瘤血管生成）为肿瘤提供营养和氧气供应，支持肿瘤扩散。血管生成的启动是由癌细胞释放血管内皮生长因子（VEGF）引发的，后者激活附近血管内皮细胞上的VEGFR-2，促进其增殖、迁移和存活[8]。此外，多项研究发现，各种类型的癌细胞表面都表达VEGF-2，如NSCLC、乳腺癌、肝癌和胃癌[9][10][11][12][13]。

VEGFR-2 TK抑制剂，如索拉非尼和苏尼替尼（图1），是ATP竞争性抑制剂，它们结合到受体的激酶结构域，从而抑制VEGF诱导的受体自磷酸化。这种机制阻止了内皮细胞中信号级联的下游激活，从而抑制肿瘤血管生成[14]。额外的证据表明，VEGFR-2抑制剂可以通过直接抑制VEGF介导的肿瘤细胞生长和侵袭来阻断自分泌信号[15][16][17]。

嘧啶是药物化学中最通用和最广泛使用的杂环骨架之一，用于设计作为抗癌剂的酪氨酸激酶抑制剂[21][22][23]。几种含有嘧啶的EGFR和VEGFR-2 TKIs在癌症治疗中取得了临床成功，并获得了FDA批准（图1）。嘧啶环与ATP的腺嘌呤环之间的相似性使得基于嘧啶的抑制剂能够竞争性地结合到激酶的ATP结合口袋，并复制与TKD铰链区的关键结合相互作用[24]。最近的文献记录了多种基于嘧啶的架构，用于双重EGFR/VEGFR-2 TK抑制，这些架构结合了易于合成、强效的双重激酶抑制作用和显著的抗增殖活性[25][26][27][28]。

在这项研究中，我们旨在设计4-氨基嘧啶-N-酰腙衍生物，这些衍生物通过靶向EGFR和VEGFR-2的ATP结合位点，同时抑制它们的酪氨酸激酶活性，从而防止自磷酸化和下游信号传导，并展示它们的抗癌效果。由于ATP位点的显著构象灵活性，可以容纳化学结构多样的小分子抑制剂[29]。对多种EGFR和VEGFR-2 TK抑制剂的构效关系（SAR）研究以及结合模式分析揭示了对两者活性都至关重要的药效团特征，这些特征可以为我们设计化合物提供依据[30][31][32][33][34][35]。EGFR TK抑制剂的基本药效团元素，以厄洛替尼（图2为例，包括：(a) 占据腺嘌呤结合口袋（铰链区域）的中央平面杂芳环部分，(b) 末端疏水头，(c) 具有氢键供体的间隔部分，(d) 末端疏水尾[33][36]。

相比之下，VEGFR-2 TK抑制剂的关键药效团特征，以索拉非尼（图2为代表，应包括：(a) 可与铰链区域相互作用的杂芳环，(b) 跨越门控区域的连接段或间隔部分，(c) 具有一个氢键受体（HBA）和一个氢键供体（HBD）的药效团，后者可以是酰胺、脲或硫脲部分，以及(d) 通过疏水相互作用能够占据别构疏水口袋的末端疏水部分[37][38][39]。

基于关于EGFR和VEGR-2抑制剂的药效团数据，我们通过药效团杂交策略（图2）设计并合成了4-氨基嘧啶-N-酰腙衍生物。这种方法得到了杂环化学最新发展的有力支持，其中骨架多样化和结构引导的优化是现代先导发现和优化的关键驱动因素[40][41][42]。通用骨架是通过整合与两类抑制剂相关的结构元素构建的。我们将嘧啶核作为平面杂芳环系统引入，以便在EGFR和VEGR-2的ATP结合裂缝中促进相互作用。此外，还将S-苄基部分引入嘧啶环中，作为与ATP结合口袋的疏水区域相互作用的疏水尾。另外，插入了4-氨基苯间隔基团，模仿厄洛替尼和吉非替尼的4-氨基基团。N-酰腙部分（–CO–NH–N=CH–）作为药效团中心，生物等效地替代了索拉非尼中的脲基团，并能够同时充当氢键供体和受体。最后，N-酰腙连接子连接到末端疏水部分（取代的芳香环、异aturing或取代的异aturing衍生物），作为可能与EGFR和VEGR-2结合位的远端疏水区域相互作用的疏水头。这种混合架构旨在在一个骨架中满足EGFR和VEGR-2抑制剂共有的药效团要求。

节片段

化学

我们目标化合物的合成路线图示在方案1中。起始物质6-甲基-2-噻氧-2,3-二氢嘧啶-4(1H)-酮1是通过在乙醇中回流等 mol量的乙酰乙酸酯、硫脲和氢氧化钾3小时来制备的[43]。通过对1在二氧环己烷/水混合物（1:1）中回流并加入氢氧化钠直至完全溶解，然后在50°C下向形成的盐中加入氯化苄基来进行S-苄基化

结论

总之，通过合理设计结合两种目标抑制剂的关键药效团特征，合成了一系列新的4-氨基嘧啶-N-酰腙衍生物（7a–k和9a–e），作为双重EGFR^WT/VEGFR-2酪氨酸激酶抑制剂。生物学评估显示化合物9e是最佳候选分子，其对A549 NSCLC细胞的细胞毒性最强（IC?? = 1.25 μM），并且具有显著的肿瘤选择性（187.5），并且是亚微摩尔级的双重激酶抑制剂

化学

使用Mel-Temp装置中的开口玻璃毛细管测定熔点，未进行校正。分析层析（TLC）以及使用波长为254 nm的紫外光监测反应进程，使用了Merck 60 F254品牌的商业硅胶板。¹H和¹³C核磁共振（NMR）光谱在DMSO-d₆或CDCl₃中进行测量，使用Mercury-300BB NMR光谱仪，¹H在300 MHz下，¹³C在75 MHz下，测量由

CRediT作者贡献声明

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

作者特别感谢埃及Galala大学药学院药物化学系的Ibrahim Mohammed Hepishy进行了本研究中报告的分子动力学模拟和MM-GBSA结合自由能计算。