解读甲萘醌-NADH轴以及通过组合工程改造Shewanella oneidensis以提高甲酸的电化学合成效率

《Bioresource Technology》：Deciphering Menaquinone-Ndh axis and combinatorial engineering of Shewanella oneidensis for boosting formate electrosynthesis

　　

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  将醌与呼吸作用相结合可以引导电子流向氧化还原代谢。
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  钨依赖的甲酸脱氢酶有利于二氧化碳的还原。
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  基于机制的工程设计将电子吸收与碳还原相结合。
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  优化后的MES平台实现了309.1 mM的高甲酸浓度。

引言

大气中二氧化碳浓度的上升以及可再生能源发电量的增加推动了将碳转化与电能输入相结合的技术发展（He等人，2023年）。微生物电合成（MES）作为一种有前景的策略出现，它利用来自电极的电子通过活细胞将二氧化碳和其他一碳底物还原为高附加值的产品（Harnisch等人，2024年；Jourdin和Burdyny，2021年；Omidi等人，2024年；Prévoteau等人，2020年）。通过将电化学还原能力与细胞内代谢相结合，MES为中性碳的生物燃料和化学品生产提供了一条潜在的可扩展和可持续的途径（Li等人，2012年；Mirea等人，2025年；Suri等人，2024年）。然而，提高MES的生产效率需要更好地理解电极产生的还原等价物是如何通过细胞呼吸网络传递并与细胞内氧化还原代谢相结合的。调控这种相互作用的分子机制尚未完全明了，这阻碍了基于机制的工程设计策略的发展（Rabaey和Rozendal，2010年）。

在电活性微生物中，细胞外电子转移（EET）途径已经被广泛研究，主要包括电子向不溶性电子受体（如金属氧化物或阳极）的转移（Beblawy等人，2018年；Kracke等人，2015年；Zhang等人，2024年；Zhao等人，2021年）。在这些系统中，金属还原（Mtr）途径作为一个成熟的通道，将细胞内的醌池与细胞外底物连接起来，从而使得呼吸作用能够超越可溶性电子受体的限制（Shi等人，2007年）。相比之下，细胞外电子吸收的分子基础仍然知之甚少（Karthikeyan等人，2019年）。在从细胞外来源吸收电子的过程中，电子必须穿过外膜、周质空间和内膜才能到达细胞内的氧化还原代谢。尽管先前的研究表明细胞外还原等价物可以通过内源性呼吸成分影响细胞内的还原代谢（Ford和TerAvest，2024年；Rowe等人，2018年；Tefft等人，2023年；Tefft和TerAvest，2019年），但这一过程的分子结构仍然不完全清楚。这种知识空白限制了对机制的理解，并限制了为了提高MES性能而对电子转移途径进行合理设计的可行性。

Shewanella oneidensis MR-1是一种模型电活性微生物，其EET机制以Mtr途径为中心，已被充分研究（Ikeda等人，2021年；Mouhib等人，2023年）。有趣的是，这一通道是可逆的，在阴极条件下可以实现电子内流，使S. oneidensis成为电合成的理想宿主（Ross等人，2011年）。此外，敲除NADH脱氢酶可以消除细胞内底物的阴极还原作用，而不影响电子的外向转移，这表明这些酶参与了阴极依赖的细胞内还原过程（Tefft等人，2023年）。然而，控制电子吸收的分子途径和调控相互作用尚未完全明了，而且细胞外电子转移可能会与内源性呼吸过程发生竞争（Ford和TerAvest，2024年）。同时，基因筛选发现了对电子吸收必要但对外向EET不必需的额外基因，表明电子吸收可能涉及与外向电子转移不同的分子成分（Rowe等人，2021年）。总的来说，这些发现表明S. oneidensis的细胞外电子吸收在生理上是可行的，并且在遗传上也是可操作的。

了解细胞外还原等价物如何转化为细胞内的还原能力对于改进微生物电合成至关重要（Zhang等人，2024年）。尽管像CymA这样的醌依赖性枢纽在呼吸网络中分配电子（Marritt等人，2012a），但将细胞外电子输入与细胞内氧化还原代谢联系起来的分子结构仍然尚未完全阐明。在这里，我们建立了一个基于甲酸相关氧化还原耦合的简单比色可视化平台，用于探测S. oneidensis中的呼吸电子路径。利用这种方法，结合遗传学、细胞内氧化还原和生物电化学分析，我们发现了与MQ相关的呼吸网络、Ndh-2以及甲酸相关电子转移过程中的细胞内氧化还原反应之间的关联。基于这些发现，通过对甲酸脱氢酶进行靶向工程和表达调控，并重新连接电子路径，增强了二氧化碳到甲酸的转化效率，实现了高产量的电驱动甲酸生产。总体而言，这项工作为探究呼吸电子路径和设计用于二氧化碳增值的电活性微生物提供了基于机制的框架。

章节片段

质粒构建和微生物培养

所有重组质粒均使用大肠杆菌 Trans T1作为克隆宿主进行构建。大肠杆菌菌株在37°C下接种于Luria–Bertani（LB）培养基中，并以220 rpm的速度摇匀培养。必要时，加入浓度为50μg/mL的卡那霉素以维持选择压力。对于S. oneidensis MR-1（ATCC 700550）的基因操作，首先在大肠杆菌中扩增质粒，然后通过电穿孔将其引入S. oneidensis。

结合甲酸氧化的电子通量表征

在S. oneidensis中，细胞外电子必须穿过三个细胞区室：外膜、周质和内膜，通过MtrCAB-CymA呼吸途径（Fonseca等人，2013年；Rowe等人，2018年）。由于这种电子内流的脆弱性和对环境干扰的敏感性，其表征具有挑战性（Rowe等人，2021年）。为了解决这一问题，我们开发了一个原位电子供应平台，以提供明确的

讨论

微生物电合成（MES）是一种有前途的二氧化碳转化平台，但其电子传输机制仍然不完全清楚（Finkelstein等人，2022年；Zhang等人，2024年）。本研究发现了S. oneidensis中MQ相关呼吸网络与甲酸依赖电子传输之间的功能关联。在所研究的呼吸成分中，Ndh-2与细胞内还原能力表现出显著的关联，这一点通过

CRediT作者贡献声明

Tailin Wang：写作——审阅与编辑，撰写初稿，可视化，验证，软件开发，项目管理，方法学，实验设计，数据分析，概念化。Ning Xu：写作——审阅与编辑，撰写初稿，可视化，监督，资源协调，项目管理，方法学，实验设计，资金获取，数据分析，概念化。Yanan Chen：可视化，验证，软件开发，方法学，实验设计。

利益冲突声明

作者声明他们没有任何已知的财务利益或个人关系可能影响本文的报告内容。

致谢

我们感谢高通量筛选平台的Lixian Wang在流式细胞术方面的帮助。本工作得到了中国科学院的战略 Priority Research Program（项目编号：XDC0110300）、国家重点研发计划（项目编号：2018YFA0901300）以及天津合成生物技术创新能力提升项目（项目编号：TSBICIP-KJGG-007）的支持。

Tailin Wang|Ning Xu|Yanan Chen|Lingcong Li|Liang Wei|Jiwei Zhang|Tao Cai|Jun Liu