好氧甲烷氧化菌通过两阶段发酵途径将甲烷转化为有机酸的代谢机制解析

《Bioresource Technology》：Revealing fermentation pathway of methane-to-organic acid bioconversion by aerobic methanotrophs

　　

揭示好氧甲烷氧化菌将甲烷生物转化为有机酸的发酵途径 甲烷是一种强效温室气体（GHG），其百年增温潜势是二氧化碳的27至30倍。本研究开发了一种两阶段甲烷发酵途径用于脂肪酸生产。研究发现，胞内储存化合物（ISCs）对甲烷氧化菌的甲烷代谢至关重要。该过程实现了高效的有机酸产率，达到8326 μmol/g DCW。研究人员建立了一个110 mL的生物反应器，用于长期将甲烷转化为脂肪酸。通过化学分析、13C标记实验、透射电子显微镜（TEM）和蛋白质组学测序等多层次分析，研究人员阐明并描绘了这一两阶段代谢过程的机制：在第一阶段，氮限制条件下甲烷被储存为胞内储存化合物（如糖原和聚羟基丁酸酯PHB）；随后，在氧气限制条件下，这些胞内化合物被发酵为甲酸和乙酸。此外，研究人员通过半连续批次实验和长期生物反应器运行，证明了通过这种两阶段甲烷发酵途径实现连续有机酸生产的可行性。这些发现推进了对好氧甲烷氧化菌代谢途径的理解，为从甲烷生物生产有机酸开辟了新途径。

研究背景与科学问题

甲烷作为一种强效温室气体，其百年增温潜势约为二氧化碳的27至30倍。随着气候变化加剧环境危害并威胁人类健康，迫切需要减少并资源化利用这些废气排放。循环经济策略可通过开发经济可行的工艺将甲烷排放转化为有价值的产品，从而在降低环境影响的同时回收甲醇、脂类、四氢嘧啶和有机酸等资源。化工行业是全球经济的支柱，2022年市场价值达5.7万亿美元，但作为化工生产主要原料的原油是不可再生且日益枯竭的资源。因此，将甲烷转化为有价值的化学品是传统石油基生产工艺的一种经济且可持续的替代方案。

传统的甲烷转化依赖物理化学技术，如费托合成，但这些工艺能耗高，需要高温高压，对于小规模甲烷源在经济上不可行。相比之下，甲烷生物转化具有资本成本低、产物特异性高和操作条件温和等优势。然而，关于甲烷生物转化为液体化学品的代谢途径知识仍然有限，这可能限制了高效生产有价值化学品的生物技术的发展。此前的研究主要通过基因改造或使用抑制剂来抑制甲烷的完全氧化，但这些方法存在运营成本高或培养和规模化困难等问题。很少有研究通过改变生长环境来刺激野生型甲烷氧化菌生产有价值化学品。

研究方法与技术路线

研究人员选取了两种典型的甲烷氧化菌模式菌株——I型的Methylococcus capsulatus Bath和II型的Methylosinus sp. LW4，通过设计两阶段批次实验、¹³C同位素标记实验、透射电子显微镜（TEM）分析和蛋白质组学测序等技术手段，系统揭示了甲烷向有机酸转化的代谢机制。此外，还构建了半连续批次反应器和膜生物膜反应器（MBfR），验证了该工艺的长期可持续性。

研究结果

3.1 甲烷氧化菌通过胞内储存化合物将甲烷转化为有机酸

在表型水平上，研究人员监测了两阶段过程中有机酸、胞内储存化合物（ISCs）和气体组成的变化。对于M. capsulatus Bath，在Stage I氧气充足条件下，低硝酸盐实验组的糖原积累量比对照组显著增加了约4倍，达到8867 μmol-C/g DCW。在此阶段未检测到有机酸和H₂的产生。进入Stage II后，当氧气降至低水平（5%）时，实验组的O₂/CH₄消耗比降至1.1，同时糖原和细菌密度分别下降了56%和23%。伴随糖原减少，观察到有机酸（主要是甲酸和乙酸）以及H₂的产生。实验组甲酸和乙酸的生产力分别为5119和3207 μmol/g DCW，这是迄今为止报道的好氧甲烷氧化菌最高值。对于M. sp. LW4，在Stage I氮限制条件下积累了聚羟基脂肪酸酯（PHA），并在Stage II氧气降低后被消耗，同样伴随着有机酸和H₂的大量产生。值得注意的是，M. capsulatus Bath未检测到PHA合成，而M. sp. LW4未检测到糖原合成，表明不同类型的甲烷氧化菌倾向于产生不同的ISCs。进一步的批次实验（Test B-D）表明，Stage I积累的ISCs在驱动Stage II的发酵过程中起着关键作用；有限的氧气促进了发酵过程；Stage II中甲烷的存在对于维持甲烷氧化菌的生物活性至关重要。

3.2 同位素标记证实胞内储存化合物是甲烷转化为有机酸的中间体

通过¹³CH₄同位素标记实验，研究人员进一步阐明了发酵途径中的碳流分布。对于M. capsulatus Bath，当Stage I单独供应¹³CH₄时，Stage II产生的乙酸盐中84 ± 0.6%的碳是¹³C标记的；而当Stage II单独供应¹³CH₄时，大部分乙酸盐（88 ± 3.9%）是非标记的。对于M. sp. LW4也得到了类似的结果，Stage II产生的乙酸盐中超过90%来源于Stage I提供的甲烷。这些结果共同证实，Stage II生成的乙酸盐主要来源于Stage I供应的甲烷，而Stage II直接将甲烷转化为乙酸盐的作用微乎其微，尽管甲烷对维持细菌活性至关重要。

3.3 甲烷发酵过程中胞内储存化合物合成与降解相关蛋白受到调控

蛋白质组学分析显示，对于M. capsulatus Bath，Stage I中实验组与糖原合成相关的蛋白（如糖原合酶GlgA上调2.9倍）显著增加，同时糖原降解相关蛋白（如糖原磷酸化酶GlgP上调3.3倍）也有所上调。Stage II中，GlgP持续上调（2.3倍），对应于观察到的糖原分解（56%）。甲酸脱氢酶亚基FdhA和FdhB显著下调，对应于甲酸的积累。乙酸的产生反映在乙酰辅酶A合成酶（AcsB）和乙酸-辅酶A连接酶家族蛋白（AcdA）的上调。对于M. sp. LW4，实验组中与PHA循环相关的蛋白显著增加，例如Stage I中phasin家族蛋白（PhaP）上调1.2倍，Stage II中进一步激增181.8倍；PHB解聚酶（Phbz）在Stage II上调4.7倍。同时，与TCA循环竞争的途径相关蛋白（如琥珀酸脱氢酶组装因子2 SDHAF2）下调3.2倍。总体而言，蛋白质组学分析证实了两种甲烷氧化菌中参与ISC代谢的蛋白受到调控，从而推动了发酵过程，在氮限制环境中产生了有机酸和H₂。

3.4 甲烷连续发酵生产有机酸

在半连续批次反应器中，M. capsulatus Bath经过5个循环共25天的运行，表现出逐渐增长的趋势，总有机酸浓度和H₂含量在每个循环结束时保持一致，表明有机酸生产力可以持续。在一个运行超过90天的110 mL膜生物膜反应器（MBfR）中，研究人员也成功实现了连续的有机酸生产。通过优化Stage II的持续时间，乙酸盐产率从约25 mg/L/d提高到70 mg/L/d。

讨论与结论

这项研究揭示了好氧甲烷氧化菌中一种高效的发酵途径，即通过两步骤将甲烷转化为有机酸：在氧气充足但硝酸盐有限的条件下，甲烷首先被储存为糖原（M. capsulatus Bath）或PHA（M. sp. LW4）；随后在氧气限制条件下，这些ISCs被发酵为有机酸和H₂。这一发现推进了对甲烷发酵机制的理解，暗示了甲烷氧化菌在不同环境中生存的替代代谢途径。

在工程应用方面，这种新型高效的甲烷生物转化途径为利用甲烷或天然气作为原料生产有价值化学品提供了新机遇。该研究在半连续批次反应器和长期连续生物反应器中均证明，通过所提出的两步发酵途径生产有机酸可以长期维持。然而，持续限制氧气会对细菌活性产生不利影响，因此在氧气充足条件下的细菌生长和氧气限制条件下的有机酸生产之间取得平衡将是技术发展的关键。与传统的厌氧消化相比，甲烷生物转化具有产物谱更简单、废弃物稳定化和化学品生产可独立优化等优势。该研究实现的有机酸产量（甲酸5112 μmol/g DCW，乙酸3207 μmol/g DCW）显著高于此前报道的一步法甲烷发酵系统。

研究结论指出，这项研究揭示了一种能够利用甲烷进行高效可持续有机酸（主要为甲酸和乙酸）生产的好氧甲烷氧化菌发酵途径。多层次分析证明，在氮限制条件下，甲烷被快速胞内储存为糖原或聚羟基丁酸酯，随后在氧气限制条件下被发酵为短链有机酸。通过优化培养环境，Methylococcus capsulatus Bath的有机酸生产力超过8000 μmol/g DCW，超越了所有先前报道的甲烷发酵系统。从工程角度，研究人员设计了半连续和连续生物发酵器，实现了稳定的有机酸产率70 mg/L/d。总之，这项工作不仅推进了微生物甲烷代谢的基础知识，也为未来将甲烷转化为有价值生物分子的生物技术应用奠定了基础。