《Bioresource Technology Reports》：PHB degradation activity of
Diaphorobacter nitroreducens B2A2W2 and the importance of 3-HB oligomer hydrolase
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本研究旨在鉴定聚3-羟基丁酸酯（PHB）降解菌株并评估其降解胞外PHB的能力，方法是将所选菌株的计算机基因组分析与降解活性的体内评价相结合。通过对科英布拉大学细菌菌种保藏中心（UCCCB）数据库中136个细菌基因组进行BLASTp筛选，以实验验证的胞外dPHA
本研究旨在鉴定聚3-羟基丁酸酯（PHB）降解菌株并评估其降解胞外PHB的能力，方法是将所选菌株的计算机基因组分析与降解活性的体内评价相结合。通过对科英布拉大学细菌菌种保藏中心（UCCCB）数据库中136个细菌基因组进行BLASTp筛选，以实验验证的胞外dPHASCL解聚酶为查询序列，保留7株符合全部筛选标准的候选菌株进行表型验证；另将Ralstonia thomasii Sid 2.1作为胞外PHB膜降解实验的阴性对照，共对8株菌进行表型实验评价。双层平板透明圈实验（halo assay）中仅Diaphorobacter nitroreducens B2A2W2（NCBI RefSeq组装号：GCF_056730635.1）产生透明圈，确认其具有胞外PHB降解表型。基因组分析显示，菌株B2A2W2携带完整的胞内与胞外PHA代谢相关基因：4个PHA合酶（PhaC，由phaC_1至phaC_4编码）、2个乙酰乙酰辅酶A还原酶（PhaB，由phaB_1和phaB_2编码）、5个乙酰辅酶A乙酰转移酶（由phaA_1、phaA_2、bktB_1、bktB_2和thlA_2编码）、3个phasin型调控基因（phaP、phaF和phbF），以及1个胞外PHB解聚酶（e_phaZ）、1个胞内PHB解聚酶（i_phaZ）、2个D(?)-3-羟基丁酸寡聚体水解酶（PhaY，由menH1和phaY编码）、1个3-羟基丁酸脱氢酶（BdhA，由bdhA编码）和1个乙酰乙酰辅酶A合成酶（AcsA2，由acsA_2编码）；并在contig 1上发现由phaC_1、phaA_1和phaB_1组成的典型phaCAB操纵子。以溶剂浇铸法制备PHB膜，在矿物培养基（MM）中以0.1%（w/v）PHB膜为唯一碳源于25–37 °C、pH 6.0–8.0、120 rpm条件下培养24–144 h，通过膜质量损失定量降解率，并设置非生物对照。结果表明：菌株B2A2W2在25–30 °C生长最佳，37 °C不生长；30 °C下48 h膜质量损失达60.25 ± 14.96%，25 °C下72 h达81.81 ± 4.34%；25 °C下pH 7时72 h降解显著高于其他pH（38.08 ± 15.92%，p < 0.05）；在25 °C、pH 7优化条件下，120 h进入稳定期，168 h最大OD600为2.93 ± 0.465，168 h时PHB膜质量损失达100%；无PHB膜时生长下降，提示PHB为偏好碳源；稳定期后膜质量损失无显著增加（p > 0.05），提示降解酶主要在指数生长期产生。培养上清经硫酸铵沉淀、透析及SDS-PAGE分离，结合nanoLC-MS/MS鉴定胞外蛋白：仅在PHB为唯一碳源时检出Band A（70 kDa）为羟基丁酸二聚体水解酶（UniProt ID：A0AAX1WVZ5；理论分子量73,900 kDa；Sequest HT得分556.335；FDR置信度高），其与菌株B2A2W2基因组编码的胞外PhaY（登录号WP_479973263.1）一致，与Ralstonia pickettii A1唯一实验确认的胞外D-(?)-3-羟基丁酸寡聚体水解酶（Zhang等，1997）具有45%一致性；Band B（48 kDa）和Band C（45 kDa）分别鉴定为氨基酸/酰胺ABC转运体底物结合蛋白（UniProt ID：A0AAX1WUN9和A0AAX1WUC6）。序列与结构分析显示，ePhaZB2A2W2与Comamonas testosteroni DSM 6781的PhaZ（AAA87070.1）具有77.16%一致性和96%覆盖度，归于II型催化域胞外dPHASCL解聚酶，其结构包含信号肽（SP）、催化域（CD）、连接域（LD）和底物结合域（SBD），催化三联体为Ser40、Asp125和His160，含脂肪酶盒基序（GxSxG）、His253氧负离子洞及SBD中保守的His459、Arg464、Cys505和sxxxHxxAGRa基序；AlphaFold2结构模型与DiffDock预测3-HB位于α/β-水解酶核心催化口袋内。ePhaYB2A2W2含23个氨基酸的预测信号肽及Gly-Phe-Ser-Ser-Gly（残基170–174）类脂肪酶盒基序，DiffDock预测3-HB单体靠近Ser172。上述基因组、蛋白质组、序列与结构证据支持ePhaZ–ePhaY协同的胞外系统模型，即ePhaZ从聚合物释放寡聚体、ePhaY将其转化为单体，单体经BdhA和AcsA2进入胞内代谢；但ePhaZ与ePhaY均未经纯化、酶活测定或基因失活验证，其催化功能仍需异源表达、酶纯化、以确定3-HB寡聚体为底物的活性实验及敲除或互补实验证实。
研究背景：石化塑料的生产与使用带来全球变暖、臭氧消耗、生态毒性和富营养化等环境负担，推动了生物塑料作为替代材料的发展。聚羟基脂肪酸酯（PHA）是微生物在营养限制与碳过量等胁迫条件下以颗粒形式产生的可生物降解聚酯，已鉴定出150余种单体，按烷基侧链碳数分为短链（scl-PHA）、中链（mcl-PHA）和长链（lcl-PHA）。其中聚3-羟基丁酸酯（P(3HB)，PHB）由90余个细菌属产生，因具良好阻隔性、高结晶度及热塑、疏水、脆性等特性而研究最多，已用于包装、消费电子、汽车、农业、纺织、组织工程和医药领域，预计2027年产量将超过100万吨，因此其生物降解研究与应用研究同样必要。PHA降解分为胞内与胞外降解，胞外PHA（ePHA）结晶度为50–60%，而胞内PHA（iPHA）为无定形态；商业与工业应用中的PHA为胞外形式，故胞外降解更受关注。部分细菌通过分泌胞外PHB解聚酶（PhaZ）将半结晶PHB降解为3-HB单体与寡聚体，再通过分泌胞外3-HB寡聚体水解酶将寡聚体水解为单体。Knoll等（2009）依据亚细胞定位、底物特异性（mcl [EC 3.1.1.76]或scl [EC 3.1.1.75]）及催化域特征将实验验证的PHA解聚酶归入八个超家族；尽管基因组与宏基因组挖掘预测的PHA解聚酶数量不断增加，但经生化表征并实验验证底物特异性的仅占少数，胞内与胞外3-HB寡聚体水解酶的信息更为稀缺，仅少数酶被分离鉴定，胞外代表仅有Ralstonia pickettii A1一例获功能验证。这些酶将PHB来源寡聚体水解为3-HB单体以利于细胞摄取与后续代谢，现有证据提示解聚酶与寡聚体水解酶在PHB胞外与胞内代谢中协同作用；完整胞内代谢还需D-3-羟基丁酸脱氢酶（BdhA）催化D-3-羟基丁酸可逆、立体特异性氧化为乙酰乙酸，以及acsA2编码的乙酰乙酰辅酶A合成酶将乙酰乙酸活化为乙酰乙酰辅酶A以供PHA生产再利用。Diaphorobacter属成员长期与PHB降解相关：D. nitroreducens最初作为从活性污泥分离的聚(3-羟基丁酸)降解反硝化细菌被描述；Diaphorobacter sp. PCA039的PHB解聚酶已获遗传与生化表征；D. polyhydroxybutyrativorans因降解聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸)而被分离。但上述研究仅聚焦透明圈实验或单一解聚酶表征，未阐明该属PHB分解代谢的基因组背景、固体PHB膜降解动力学，也未解析聚合物存在时分泌蛋白组的组成。本研究旨在通过整合所选菌株的计算机基因组分析与降解活性的体内评价，鉴定PHB降解菌并评估其降解胞外PHB的能力；通过对新表征菌株的完整PHA合成与降解机器进行全基因组清点、对溶剂浇铸PHB膜降解进行定量且条件分辨的测定、并鉴定降解过程中分泌的蛋白，弥补上述空白。研究证明，仅当PHB为唯一碳源时胞外3-HB寡聚体水解酶被特异释放，提示存在罕见的协同胞外ePhaZ–ePhaY系统，据研究人员所知此前未见Diaphorobacter属的类似报道。
研究人员开展的研究与结论及意义：研究人员建立基因组导向的筛选流程并结合表型与蛋白质组验证，从现有菌种保藏中回收PHB降解能力，获得一株稳健且表征充分的PHB降解菌D. nitroreducens B2A2W2；该菌株在25 °C、pH 7的温和近环境条件下168 h内完全降解溶剂浇铸PHB膜。研究提示该菌株是有前景的biotechnological候选者，直接适用于：i）作为接收PHB基包装的堆肥与厌氧消化线的接种物或生物强化剂；ii）作为污水处理厂PHB残留的生物后处理步骤，Diaphorobacter菌种本就是活性污泥群落的常见成员；iii）作为可催化PHB可控解聚为3-羟基丁酸酶的来源，为化学回收与新型聚合物材料合成提供平台；iv）作为PHB基材料标准化常温生物降解测试的参考菌株。更广泛而言，所述工作流程可迁移至其他生物聚合物与菌种保藏，且胞外寡聚体水解酶响应PHB而产生并分泌的发现表明，寡聚体加工酶作为酶发现与工程改造的靶标值得更多关注；ePhaZ与ePhaY的纯化与生化表征以及在真实环境条件下对商业PHB制品的测定，是将这些发现转化为过程规模应用所需的下一步。
关键技术方法：研究人员通过对UCCCB数据库136个细菌基因组进行BLASTp筛选（以Knoll等（2009）验证的胞外PHASCL解聚酶为查询序列，并按氨基酸一致性、查询覆盖度、E-value与Bit score排序，结合RAST注释核查基因与PHA代谢的关联）选定候选菌株，菌株来源为科英布拉大学细菌菌种保藏中心（UCCCB）数据库；采用双层平板透明圈实验进行表型确认；采用溶剂浇铸法（Anbukarasu等，2015）制备PHB膜并进行定量膜质量损失降解实验（含非生物对照与生物、技术重复）；采用硫酸铵沉淀、透析、SDS-PAGE与nanoLC-MS/MS（配备FAIMS接口）鉴定胞外蛋白；采用MEGA-11的MUSCLE算法进行序列比对、SignalP预测信号肽、Neighbour-Joining法（Poisson模型，1000次bootstrap）构建系统发育树，并使用Neurosnap平台工具进行结构建模与对接预测；采用R软件（版本4.3.3）进行方差分析（ANOVA）及Tukey多重比较检验（p < 0.05）。
研究结果：
3.1 潜在PHA降解菌株的鉴定：通过对UCCCB数据库136个细菌基因组的BLASTp筛选，在多个菌株中检索到实验验证的胞外dPHASCL解聚酶同源物，保留7株符合全部筛选标准的候选PHB降解菌进行透明圈表型确认；7株候选菌中仅D. nitroreducens B2A2W2在双层琼脂平板产生透明圈，确认胞外PHB降解表型；上层为TSA培养基时降解面积大于MM，且菌株B2A2W2仅在以TSB加PHB预培养时才能在MM琼脂中降解PHB，表明接种物生理状态强烈影响解聚酶产生；其余6株无透明圈并不证明其不能降解PHB，可能反映所测条件下PhaZ表达量低或琼脂凝胶结构阻碍分泌酶扩散，这也是透明圈筛选公认的局限，说明需将基因组预测与定量降解实验结合。
3.2 遗传组织：PHA相关基因与操纵子：基因组分析显示菌株B2A2W2携带完整的胞内与胞外PHA代谢相关基因，包括完整生物合成机器（4个PhaC、2个PhaB、5个乙酰辅酶A乙酰转移酶及3个phasin型调控基因phaP、phaF、phbF）和降解相关功能（1个e_phaZ、1个i_phaZ、2个PhaY、1个bdhA、1个acsA_2），并在contig 1上发现由phaC_1、phaA_1和phaB_1组成的典型phaCAB操纵子；ePhaZ、iPhaZ、PhaY型寡聚体水解酶、BdhA与AcsA2的同时存在表明菌株B2A2W2编码将胞外PHB转化为可代谢中间产物所需的完整酶路线。
3.3 D. nitroreducens B2A2W2对PHB膜的降解：通过不同温度、pH与时间的膜质量损失测定，菌株B2A2W2最适生长温度为25–30 °C，37 °C不生长，30 °C下48 h膜质量损失达60.25 ± 14.96%，25 °C下72 h达81.81 ± 4.34%（p < 0.05）；25 °C下pH 7时72 h降解显著最高（38.08 ± 15.92%，p < 0.05）；在25 °C、pH 7优化条件下120 h进入稳定期、168 h最大OD600为2.93 ± 0.465，168 h膜质量损失达100%，无PHB膜时生长下降提示PHB为偏好碳源，稳定期后膜质量损失无显著增加（p > 0.05）提示降解酶主要在指数生长期产生；显微观察显示膜表面渐进性碎裂、开裂与侵蚀并与质量损失相关，非生物对照无可检测变化。与已有研究比较，在类似MM条件下Jeon等（2023）报道Bacillus infantis PD3 5 d降解98.71%，Martínez-Tobón等（2018）7 d获得15%–90%质量损失，Aeromonas caviae Kuk1-(34)需45–49 d达89%–94%；已表征的高效降解菌酶多为嗜热或需35 °C以上才有最大活性；菌株B2A2W2在25 °C、pH 7、168 h内完全降解0.1%（w/v）PHB膜且72 h已超80%质量损失，使其跻身迄今报道的最有效中温PHB降解菌之列，且测定温度低于多数已发表实验，直接适用于常温废物处理；该属先前报道仅限于PHB平板透明圈观察或PCA039单一解聚酶表征，本研究提供定量膜降解动力学、完整基因组信息与组织及LC-MS/MS胞外蛋白鉴定。
3.4 PHB降解过程中胞外酶的检测：通过比较PHB与/或甘油培养上清的SDS-PAGE蛋白谱并联用LC-MS/MS，发现Band A（70 kDa）鉴定为羟基丁酸二聚体水解酶（UniProt ID：A0AAX1WVZ5；理论分子量73,900 kDa；Sequest HT得分556.335；FDR置信度高），仅在PHB为唯一碳源时检出；Band B（48 kDa）与Band C（45 kDa）分别鉴定为氨基酸/酰胺ABC转运体底物结合蛋白（A0AAX1WUN9与A0AAX1WUC6）；该胞外PhaY与Ralstonia pickettii A1唯一实验确认的胞外D-(?)-3-羟基丁酸寡聚体水解酶具有45%一致性；这种底物依赖的胞外蛋白产生模式与PHB解聚酶表达受易代谢碳源抑制、待其耗尽后诱导的既往观察一致，寡聚体水解酶在PHB条件下独家检出提示其产生受调控，但数据反映的是其分泌与调控而非催化活性。
3.5 D. nitroreducens B2A2W2胞外PhaZ与PhaY的氨基酸序列分析：通过序列比对、系统发育与结构建模预测，ePhaZB2A2W2与Comamonas testosteroni DSM 6781的PhaZ（AAA87070.1）具有77.16%一致性和96%覆盖度，归于II型催化域胞外dPHASCL解聚酶；其结构含信号肽（SP）、催化域（CD）、连接域（LD）和底物结合域（SBD），N端20个氨基酸的预测信号肽、催化三联体Ser40、Asp125、His160、脂肪酶盒基序（GxSxG）、His253氧负离子洞、连接域纤连蛋白III型（Fn3）指纹序列及SBD中保守的His459、Arg464、Cys505与sxxxHxxAGRa基序；AlphaFold2模型呈典型α/β-水解酶折叠，DiffDock预测3-HB占据催化口袋并靠近催化三联体与His253；与Comamonas酶的高一致性提示序列一致性本身对降解性能预测能力差，酶产生的生理背景同样重要。ePhaYB2A2W2与Ralstonia pickettii A1胞外D-(?)-3-羟基丁酸寡聚体水解酶（BAA20331）具有45.70%一致性，比对发现残基170–174的Gly-Phe-Ser-Ser-Gly五肽类脂肪酶盒基序，而R. pickettii A1酶相应区域无此基序；N端预测23个氨基酸信号肽，DiffDock将3-HB单体（PubChem CID 441）定位于Ser172附近；仅凭序列比对未能可靠鉴定完整催化三联体。综合基因组、蛋白质组、序列与结构证据支持ePhaZ释放寡聚体、ePhaY转化为单体后经BdhA与AcsA2内化进入代谢的协同胞外系统模型（图9），但该模型基于序列相似性、结构预测、对接与蛋白鉴定，本研究中ePhaZ与ePhaY均未纯化、未测活、未遗传失活，需异源表达、酶纯化、以确定3-HB寡聚体为底物的活性实验及敲除或互补实验方能确认其催化作用，这也是本研究的自然延续。
讨论与结论：随着PHB在包装、农业、消费品与生物医学领域应用的扩大，其使用量预计持续增长，开发安全的PHB生物降解处置工艺以避免加剧塑料废物问题十分必要，高效可预测的报废路线是PHB更广泛部署的前提。本研究证明，基因组导向的筛选流程结合表型与蛋白质组验证，是从现有菌种保藏中回收此类能力的有效途径，并获得表征充分的稳健PHB降解菌D. nitroreducens B2A2W2；该菌株在25 °C、pH 7的温和近环境条件下168 h内完全降解溶剂浇铸PHB膜，提示其是有前景的biotechnological候选者，直接适用于：i）作为接收PHB基包装的堆肥与厌氧消化线的接种物或生物强化剂；ii）作为污水处理厂PHB残留的生物后处理步骤，Diaphorobacter菌种本就是活性污泥群落的常见成员；iii）作为可催化PHB可控解聚为3-羟基丁酸酶的来源，为化学回收与新型聚合物材料合成提供平台；iv）作为PHB基材料标准化常温生物降解测试的参考菌株。更广泛而言，所述工作流程可迁移至其他生物聚合物与菌种保藏，且胞外寡聚体水解酶响应PHB而产生并分泌的发现表明，寡聚体加工酶作为酶发现与工程改造的靶标值得更多关注；ePhaZ与ePhaY的纯化与生化表征以及在真实环境条件下对商业PHB制品的测定，是将这些发现转化为过程规模应用所需的下一步。
