《Biosensors and Bioelectronics》：N-heterocyclic engineering of covalent organic framework (COF)-microenvironments for the development of enzyme-based biosensor with application to lung cancer diagnosis
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摘要
在开发高性能基于酶的生物传感器过程中，保持和提升天然酶的催化活性仍然具有挑战性。在这项工作中，我们提出了一种合理的配体工程策略，通过将氮杂环微环境调控与深度共晶溶剂（DES）辅助的温和合成方法相结合，来构建酶@共价有机框架（COF）复合材料，从而提高酶的活性。此外，还制
摘要
在开发高性能基于酶的生物传感器过程中，保持和提升天然酶的催化活性仍然具有挑战性。在这项工作中，我们提出了一种合理的配体工程策略，通过将氮杂环微环境调控与深度共晶溶剂（DES）辅助的温和合成方法相结合，来构建酶@共价有机框架（COF）复合材料，从而提高酶的活性。此外，还制备了一种高性能生物传感器，用于检测非小细胞肺癌（NSCLC）来源的外泌体。具体来说，将富含氮的配体引入COF框架中可以在DES提供的生物相容性条件下创建一个富含电子的氢键微环境，促进COF的快速原位生长。酶动力学分析表明，引入氮杂环配体可以有效提升酶的催化效率，光谱分析进一步确认了引入含氮配体后酶的构象变化。因此，基于酶@COF复合材料制备了一种高性能电化学生物传感器，用于检测NSCLC来源的外泌体。实验结果显示，该生物传感器具有宽线性检测范围，并且检测限（LOD）可低至4个颗粒/μL。此外，临床样本分析证实了其准确区分NSCLC患者和健康个体的能力。
引言
基于酶的生物传感器仍然是生物传感领域的主要研究焦点（Bell等人，2024；Fu等人，2018）。然而，它们的实际应用往往受到酶操作稳定性不足的限制。天然酶对环境条件（包括温度、pH值、离子强度和复杂样本基质）非常敏感，这些条件容易引发构象变形和催化活性的不可逆丧失（Kurbanoglu等人，2020；Reyes-De-Corcuera等人，2018）。因此，研究合适的酶载体至关重要，因为载体基质提供的适当环境可以有效保持酶的构象并维持其催化功能（Kumari等人，2020；Makrydaki等人，2024；Shi等人，2025；Wang等人，2026）。在各种载体材料中，共价有机框架（COFs）（Bhunia等人，2020；Fang等人，2015；Li等人，2020；Xu等人，2024）是一类由轻元素通过强健的共价键构建的结晶多孔材料，作为酶固定的有前途的支架（Huang等人，2022；Qiao等人，2026；Zheng等人，2024；Zhou等人，2023）。由于其高度有序的结构、可调节的孔环境和化学稳定性，COFs能够在极端pH值、高温和有机溶剂暴露等恶劣条件下稳定酶并调节分子相互作用（Geng等人，2020；Huang等人，2016；Zhou等人，2024）。此外，它们在血清等复杂生物介质中的优异稳定性进一步凸显了其在基于酶的生物传感和治疗应用中的潜力（Abadijoo等人，2024；Wang等人，2022；Zhao等人，2021；Zhou等人，2026）（见图1）。
尽管具有这些优势，但实际构建酶@COF复合材料仍然具有挑战性，因为传统的COF合成方法通常需要与酶稳定性和催化活性不兼容的苛刻反应条件（Ma等人，2019；Zhao等人，2025；Zheng等人，2022）。尽管已经探索了温和的水相或机械化学方法来保持酶活性（Li等人，2023；Liang等人，2023；Talekar等人，2023；Zhang等人，2023），但这些条件下相对缓慢的共价键形成往往导致COF的结晶度、孔隙有序性和结构可控性不足，可能会影响底物的亲和力和固定酶的催化性能（Paul等人，2025；Shi等人，2025）。因此，开发与酶兼容的策略以构建高度有序的COF对于推进基于酶@COF的催化系统至关重要。我们之前的研究建立了一种有效的酶@COF复合材料原位合成方法，并发现配体结构可以调控所得COF的形态（Wang等人，2025）。最近的研究表明，通过调整COF孔内的化学环境可以调控酶的催化行为（Xing等人，2022，2025）。然而，现有方法主要依赖于合成后的修饰，这通常涉及复杂的程序，并且对孔内功能团的空间分布和化学特性控制有限。
在这项工作中，我们提出了一种通过配体介导工程在COF中调控富含氮的杂环微环境的策略来构建酶@COF复合材料。同时，提出了一种深度共晶溶剂（DES）辅助的温和合成方法，以促进与酶兼容的COF生长并保持酶的活性。重要的是，将富含氮的杂环配体引入COF框架中可以生成一个富含电子的微环境，从而调节酶与框架的相互作用。酶动力学实验表明，当引入N-杂环配体时，酶的催化速率在一定程度上得到提升，最大提升幅度为2.2倍。此外，基于这些优化的酶@COF复合材料，制备了一种高性能电化学生物传感器，用于超灵敏地检测非小细胞肺癌（NSCLC）来源的外泌体，检测限为4个颗粒/μL，有助于肺癌的早期诊断。
节段片段
深度共晶溶剂（ChCl/U）的制备
按照先前报道的方法（Azizi和Dezfooli，2016a），将氯化胆碱和尿素以1:2的摩尔比混合并在60°C下搅拌30分钟，得到透明液体，然后在60°C下真空干燥过夜。
HRP@NX-COFs的合成
HRP@NX-COFs在温和条件下合成。将10毫克HRP和10.5毫克的Tp在2毫升DES溶液中以800转/分钟的转速搅拌30分钟。随后加入16.7毫克的TAPB（相当于TAPD、TAPM、TAPT）和5.5毫克的Tp，混合物
材料表征
通过Schiff碱缩合反应合成了β-酮胺连接的共价有机框架，使用了DES，特别是氯化胆碱/尿素体系（Azizi和Dezfooli，2016b；Gao等人，2026；Qiu等人，2020）。这种DES介质不仅有效地促进了亚胺的形成，还为辣根过氧化物酶（HRP）的固定提供了生物相容性环境，减少了活性损失。如图1a所示，一系列HRP@NX-COFs具有不同的
结论
总之，本研究提出了一种通过配体介导的微环境工程策略来构建酶@COF并制备高性能生物传感器。使用DES作为生物相容性反应介质实现了酶@COF复合材料的原位生长，同时将N-杂环配体引入COF骨架中精确调节了化学微环境，最终得到高活性的HRP@COF。因此，所得到的HRP@COF可以用作信号探针
CRediT作者贡献声明
Tianci Zhou:撰写 – 原稿撰写、方法学、实验研究、概念设计。Zhiyue Wang:验证、监督、实验研究。Ying Deng:撰写 – 原稿撰写、方法学、实验研究。Yu Sun:验证、方法学、实验研究。Man Xue:验证、实验研究。Bing Bo:撰写 – 审稿与编辑、资金申请。Zhaoxia Wang:撰写 – 审稿与编辑、资金申请。Genxi Li:撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、资金申请。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：82573366）和江苏省自然科学基金（编号：BK20251962）的支持。
Tianci Zhou|Zhiyue Wang|Ying Deng|Yu Sun|Man Xue|Bing Bo|Zhaoxia Wang|Genxi Li
