SHIELD：一种由Argonaute技术驱动的、无需固定剂的无偏倚电化学生物传感器，用于超高灵敏度检测活病原体

《Biosensors and Bioelectronics》：SHIELD: An Argonaute-Powered Immobilization-Free Homogeneous Electrochemical Biosensor for Ultrasensitive Viable Pathogen Detection

　　### 摘要
准确识别可存活的食源性病原体对于预防食源性疾病爆发至关重要。在此，我们开发了一个名为SHIELD的平台（基于Argonaute的灵敏、均相、无固定化的电化学活细菌检测方法）。该策略利用Argonaute引导的切割作为主要的电化学转导机制，规避了与表面固定传感器相关的重复性问题。关键在于，该系统通过加入Propidium Monoazide（PMA）预处理有效地消除了来自死亡细菌的假阳性结果，PMA能够选择性地阻断死亡细菌中的残留DNA。结合Argonaute的高度特异性DNA切割能力，确保了仅检测到可存活的鼠伤寒沙门氏菌。在检测过程中，目标DNA经过等温扩增（LAMP）产生大量扩增子，随后目标激活的Argonaute程序性地切割带有双甲基蓝（MB）和生物素标记的电化学探针。未反应的探针通过链霉亲和素磁分离去除，从而显著增强了“信号开启”反应。该平台在70分钟内实现了低至1 CFU/mL的检测限。通过结合PMA和Argonaute的特异性以及无固定化设计的效率，SHIELD展现了一种可靠且创新的电化学生物传感方法，为快速、灵敏地筛查可存活的食源性病原体提供了有希望的解决方案。

### 引言
由病原细菌引起的食源性疾病对人类健康和全球经济构成了严重威胁（Peng等人，2024年；Reta、Saint、Michelmore、Prieto-Simon和Voelcker，2018年；Shen、Xu和Li，2021年）。准确检测可存活细菌对于有效控制风险至关重要。目前，平板计数法被广泛认为是金标准（Mooijman，2018年）。然而，该方法受到长时间孵育的限制，并且无法检测到保持致病性但不形成菌落的VBNC细菌（Fakruddin、Mannan和Andrews，2013年；Lagier等人，2015年），这导致了安全评估的假阴性结果，并使得快速现场筛查变得困难。另一方面，作为最广泛采用的现代分子生物学技术，PCR和定量PCR（qPCR）显著提高了检测速度和灵敏度，并具有高特异性。然而，这些方法无法区分来自可存活病原体的信号和来自死亡细菌的游离DNA残留物，这一限制直接导致了假阳性结果，进而导致风险评估过高和不必要的经济损失。更重要的是，这些技术严重依赖复杂的大型设备和专门培训的人员，这成为其在便携式、快速现场检测中的应用瓶颈（Rossi、Coulon、Ma、Zhang和Yang，2023年）。因此，迫切需要一种不仅快速灵敏而且能够识别所有可存活病原体的通用检测策略，以确保食品安全。在常见的食源性病原体中，鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）是导致严重人类感染的主要血清型（Johnson、Mylona和Frankel，2018年；Kaavya等人，2021年）。它以其能够在食品加工环境中持续存在而臭名昭著。随着病原污染变得更加隐蔽、复杂和普遍，传统检测方法在识别可存活细菌方面的局限性已成为主要问题。因此，开发一种精确的靶向检测策略对于满足食品安全需求和构建有效的检测系统至关重要。

### 可编程核酸技术
如CRISPR/Cas和Argonaute系统，其特点是序列设计的稳健性、高特异性和灵活的信号放大能力。这些特性为实现病原体的精确识别提供了新策略，并能够进行级联信号放大（Liu等人，2025年；Mao等人，2022年）。Argonaute作为一种可编程核酸酶，可以分为真核Argonaute和原核Argonaute（He等人，2019年）。原核Argonaute系统已成为CRISPR/Cas在体外诊断中的强大补充（Graver、Chakravarty和Solomon，2023年；J. Zhang等人，2024年）。与CRISPR/Cas不同，Argonaute不受严格的PAM序列限制，利用短的、化学稳定的DNA引导序列以单碱基特异性切割目标核酸（Qiao等人，2025年；Qin、Li和Hu，2022年）。这些固有优势促进了灵活的检测设计并降低了成本，使Argonaute成为下一代分子诊断的强大工具。利用这些特性，最近的Argonaute介导的策略实现了高灵敏度的病原体检测（Y. Li、Jia、Man、Ye和Ma，2023年；Shang等人，2025年；Yang等人，2023年），主要依赖于荧光读数（Huang、Wei、Zhou、Li和Chen，2024年；Qiao等人，2024年；N. Wang等人，2024年；Xun、Lane、Petrov、Pepa和Zhao，2021年；Ye等人，2022年）。然而，一个关键的限制仍然存在：传统的核酸测试无法区分可存活病原体和来自死亡细菌的游离DNA。这种无能严重影响了诊断准确性，特别是在食品安全监测中，因为非活性生物体的残留DNA非常普遍。尽管基于Argonaute的荧光检测方法已经得到了巧妙的设计，但实现可存活细菌检测的方法在多功能性和实用性方面仍然有限。例如，最近的一项研究采用了噬菌体辅助的DNA和ATP协同触发PfAgo系统（PDAAF）（X. F. Wang等人，2024年），其中噬菌体裂解可存活细菌以释放DNA和ATP，用于后续的导向DNA加载和荧光探针激活。虽然这种方法保证了高特异性，但依赖于噬菌体带来了挑战，如需要为特定目标定制噬菌体，这限制了其广泛应用。此外，这些光学方法仍然依赖于笨重的仪器和复杂的光学设置，限制了其在现场筛查中的实用性。

### 电化学生物传感
对于实际样本中的目标检测，电化学生物传感具有独特的抗基质干扰能力、与未纯化样品的良好兼容性以及通过界面修改可调的选择性（Bojdi等人，2016年；Bojdi等人，2015年；Bojdi等人，2015年；Bojdi等人，2015年；Bojdi等人，2014年；Hosseini等人，2014年；Sánchez-Estébanez等人，2018年；Tashkhourian、Daneshi、Nami-Ana、Behbahani和Bagheri，2016年）。它还具有快速信号转导、高灵敏度以及与经济实惠的便携式设备的兼容性（Benvidi和Jahanbani，2016年；Benyidi、Tezerjani、Jahanbani、Ardakani和Moshtaghioun，2016年；Han、Wang和Wang，2024年；Jahanbani和Benvidi，2016年；Kharismasari等人，2024年；Sankar、Kuzmanovic、Schaus、Galagan和Grinstaff，2024年；Wachholz Junior和Kubota，2024年）。通过结合Argonaute系统的可编程切割特异性和这些有利特性，同时消除了对笨重光学仪器的依赖，这种协同作用将基于Argonaute的检测从专门的实验室中心荧光检测转变为适用于快速现场病原体筛查的实际工具。尽管有这些明显优势，但专门设计用于区分可存活病原体的基于Argonaute的电化学平台的发展仍然很大程度上尚未探索。

### SHIELD平台的设计与原理
在本文中，我们报告了一个新型的无固定化电化学生物传感平台，该平台将Argonaute系统与基于PMA的活力区分结合。通过加入磁分离，这种传感器基于“信号开启”机制工作，能够实现高灵敏度和特异性的可存活S. Typhimurium检测。如图1所示，SHIELD通过三部分机制运行：基于PMA的活力门控、Argonaute介导的级联激活和电化学信号。

### 结论
总之，本研究首次将Argonaute系统与无固定化电化学传感器集成，实现了可存活S. Typhimurium的快速和超高灵敏度检测。通过利用Argonaute蛋白的高序列特异性和精确切割活性以及PMA介导的可存活和死亡细菌的区分，该检测方法确保了准确的靶标识别并有效消除了假阳性结果。

### 作者贡献声明
Jiali Qiao：撰写——原始草稿、验证、正式分析。
Baoqing Bai：撰写——审阅与编辑。
Yukun Yang：撰写——审阅与编辑、可视化、项目管理、资金获取。
Shuo Wang：撰写——审阅与编辑。
Ying Zhang：撰写——审阅与编辑。
Wenyan Yan：撰写——审阅与编辑。
Wenbo Lu：撰写——审阅与编辑。

### 未引用参考文献
Bojdi等人，2015年；Bojdi等人，2016年；Bojdi等人，2014年；Qin等人，2022年；Shen等人，2021年；Wang等人，2024年。

### 利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。

### 致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号32603533、32072301）、中央政府指导地方科技发展基金项目（编号YDZJSX2025D009）和山西省基础研究计划（自由探索）（编号202403021222017）的财政支持。