珠支撑的正交共定位邻近扩展检测方法：用于泌尿结石早期诊断的多重蛋白检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Bead-supported orthogonal colocalized proximity extension assay: multiplex protein detection toward early diagnostic applications for urolithiasis

　　

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  Ort-CPEA 能实现高灵敏度的多重蛋白质检测。
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  共定位 PEA 可加速目标识别的动力学。
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  Nt.BstNBI 可实现与 DNA 正交的荧光读数。
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  该检测方法使用尿液样本可以早期诊断尿石症。

引言

尿石症是一种常见且复发的泌尿系统疾病，给全球医疗保健带来了沉重的负担（Guan 等，2025）。早期识别与尿石症相关的病理变化可以及时进行临床干预和个性化的生活方式管理，有效防止梗阻性肾病的进展，消除严重的肾绞痛，并避免需要创伤性手术治疗（Abou-Elela 2017；Dave 等，2026）。目前，尿石症的临床诊断主要依赖于传统的影像检查方法，包括腹部超声波和非对比计算机断层扫描（Mirfazaelian 等，2020；Chen 等，2020）。然而，这些传统的成像技术只能识别成熟的肉眼可见的结石，无法捕捉到结石形成早期的微妙分子异常（Sun 等，2024）。此外，对于高风险和复发的患者，定期进行 CT 重新检查不可避免地会增加累积的辐射暴露，限制了其在长期人群监测中的应用（Pi?ta 等，2026）。

越来越多的蛋白质组学和临床证据表明，三种关键的泌尿系统功能蛋白——Tamm-Horsfall 蛋白（THP/uromodulin）、骨桥蛋白（OPN）和 Fetuin-A，在结石发病机制中对草酸钙晶体的形成、生长和聚集起着核心调控作用（Marengo 等，2022；Wu 等，2014；Liu 等，2010）。这三种蛋白作为尿石症早期筛查和风险评估的无创生物标志物具有巨大潜力（Huang 等，2026；Lasota 等，2023）。然而，目前仍缺乏可靠的多重检测平台，能够同时定量分析临床样本中的这三种泌尿系统蛋白标志物，这极大地阻碍了这些生物标志物的实际应用。

酶联免疫吸附测定（ELISA）是临床实验室中最常用的蛋白质检测方法。然而，它在早期疾病筛查方面存在明显缺点（Pillay 等，2025）。它无法很好地检测低浓度标志物，需要多次操作步骤，耗时较长，并且一次只能检测一个目标，多重检测能力有限。为了解决这些问题，已经开发了多种新的蛋白质检测平台，如单分子阵列（Simoa）（Rissin 等，2010；B?ken 等，2025）、滴液数字 ELISA（ddELISA）（Cohen 等，2020）、用于单个计数的分子珠信号放大技术（MOSAIC）（Wu 等，2022；Wu 等，2020；Zhang 等，2024）、核酸连接免疫夹心测定（NULISA）（Feng 等，2023）以及基于 DNA 的多重检测平台 nELISA（Dagher 等，2025）。尽管如此，这些平台仍需要昂贵的实验室仪器和经过培训的专业人员（Yassin 等，2025；Liu 等，2025a）。最近，为了实现高灵敏度的蛋白质检测，已经开发了一些适合临床应用的微型传感器设备，包括电化学、电化学发光和荧光传感器（Fu 等，2026；Esporrín-Ubieto 等，2025）。这些平台依赖于新型纳米材料（Zeng 等，2026；Wei 等，2026；Yu 等，2026；Kuhner 等，2026）、基于 DNA 的信号放大技术（Zhang 等，2026；Malhotra 等，2026；Guang 等，2025）或这些策略的组合（Hang 等，2026；Ran 等，2026）。然而，这些传感方法要么需要复杂的纳米材料合成，要么多重检测能力有限，因为其多重检测通常依赖于空间模式或有限数量的光谱可分辨标签。

邻近扩展测定（PEA）通过邻近触发的 DNA 扩增实现高特异性和高灵敏度，能够记录双抗体-抗原结合事件（Al-Amin 等，2022；Zhang 等，2022；Wang 等，2026）。然而，这项技术由于需要两种抗体同时结合一个分析物，因此目标识别速度较慢，且其多重检测能力受到探针配对和解码复杂性的限制（Sun 等，2026；Bellanti 等，2024）。在这里，我们构建了一个基于珠子的正交共定位 PEA（Ort-CPEA）平台，用于 THP、OPN 和 Fetuin-A 的高灵敏度多重检测。抗体对预先固定在磁微球上，以加快抗原识别的动力学。此外，我们利用切割内切酶 Nt.BstNBI 的严格错配依赖性切割特性，从双链 DNA 底物产生正交荧光信号。我们的 Ort-CPEA 系统能够在单个反应管中同时测量多种生物标志物，这对尿石症检测技术的进步具有重要意义。

部分摘要

材料与试剂

所有合成核苷酸序列均由 Sangon Biotech（中国上海）合成。Dynabeads? MyOne Streptavidin C1 超顺磁珠（标称直径 1.05 μm；产品编号 65001）购自 Thermo Fisher Scientific（立陶宛维尔纽斯）。用于 THP 检测的未标记捕获抗体（Thermo Fisher，产品编号 PA5149921）和生物素连接的检测抗体（Bio-Techne R&D Systems，产品编号 BAF5144）也来自同公司。用于 OPN 检测的捕获抗体（Abcam，产品编号……）

Ort-CPEA 的工作原理

Ort-CPEA 方法的关键组成部分包括预功能化的磁珠、CS 链、切割内切酶 Nt.BstNBI 和报告探针（图 1）。预功能化的磁珠通过生物素-链霉亲和素相互作用与捕获抗体 1（Ab1）结合。检测抗体 2（Ab2）通过与 S0 链的部分杂交预先固定在磁珠上。在目标蛋白存在的情况下，磁珠上的 Ab1 和 Ab2 快速捕获目标分析物

结论

总的来说，我们建立了一种基于珠子的正交共定位邻近扩展测定方法，称为 Ort-CPEA，可以实现快速、超灵敏度和一锅法的多重蛋白质检测。共定位邻近扩展配置显著增强了目标识别的动力学，其观察到的动力学速率常数大约是传统 PEA 方法的 10 倍。通过与 Nt.BstNBI 介导的 DNA 正交反应系统的结合，该检测方法实现了……

CRediT 作者贡献声明

Lvwen Zhang：撰写 – 审稿与编辑，验证，资金获取。Dandan Zhou：监督，项目管理和资金获取。Zongyao Hao：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取，概念构思。Yuehan Yang：撰写 – 初稿撰写，形式分析，概念构思。Zhiwei Jiang：撰写 – 初稿撰写，方法学设计，概念构思。Yanheng Huang：验证，资源提供。Qiushi He：验证，资源提供，数据管理

Liu 等，2025；Marengo 等，2002。

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能会影响本文报告的工作。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能会影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（82370768）、安徽省高校的男性泌尿系统疾病杰出科研创新团队（2022AH010071）以及重庆市科学技术基金会（CSTB2023JXJL-YFX0052）的支持。

Zhiwei Jiang|Yuehan Yang|Qiushi He|Yanheng Huang|Dandan Zhou|Lvwen Zhang|Zongyao Hao