设计一种全细胞催化剂，以增强2,5-双(羟甲基)呋喃的产量，并研究其对深共晶溶剂的细胞响应

《Bioresource Technology》：Engineering a whole-cell catalyst for enhanced production of 2,5-bis(hydroxymethyl)furan and comparative cellular responses to deep eutectic solvents

　　•HetN被鉴定为一种新型的SDR氧化还原酶，具有较高的HMF还原活性。•T140Q/V39H突变体在1.8小时内能够将200 mM的HMF转化为超过99%的BHMF。•建立了一种从d-果糖到BHMF的0.5小时一锅法化学-生物催化路线。•不同的深度嵌入溶剂（DESs）引起了共性的和DES特异性的细胞和代谢扰动。

引言
化石资源的枯竭以及日益严重的环境问题推动了从可再生纤维素生物质中生产高附加值化学品的广泛研究（Chen等人，2023年；Kim等人，2025年；Mika等人，2017年）。5-羟甲基糠醛（HMF）是通过C6糖的酸催化脱水获得的，被美国能源部认定为一种重要的平台化学品（Chen等人，2024年；Ku等人，2025年；Xu等人，2020a年）。其衍生物2,5-双（羟甲基）呋喃（BHMF）通过选择性还原HMF的醛基而生成，是合成聚合物、冠醚、药物和燃料添加剂的多功能构建块（Balakrishnan等人，2012年；Post等人，2023年；Zhang等人，2021年）。目前，BHMF可以通过化学氢化或生物催化还原方法制备。使用贵金属催化剂（如Pt、Ru和Pd）或非贵金属催化剂（如Ni、Cu和Co）进行化学氢化可以显示出较高的BHMF产率和生产效率，但通常需要高压氢气、高温和有机溶剂，这可能导致能耗增加、安全隐患以及不希望出现的过度氢化副产物（Hu等人，2018年；Liu等人，2025年；Wan和Lee，2021年）。此外，一些Hf和Zr基的酸碱催化剂也被证明可以在常压下使用液态氢供体（如乙醇和异丙醇）将HMF转化为BHMF，尽管选择性相对较低（Hao等人，2016年；Hu等人，2019年）。相比之下，使用整个细胞或分离的酶进行生物催化还原可以在温和的水性条件下进行，具有较高的BHMF选择性、较少的副产物生成以及更好的环境兼容性（Wang等人，2020年；Xu等人，2018年）。值得注意的是，分离的酶通常需要额外的辅因子再生系统来完成NAD(P)H依赖性的还原，而整个细胞催化剂可以在细胞内再生NAD(P)H，这对于HMF的生物还原是有利的（Yang等人，2025年）。自从Li等人在2017年进行的开创性研究以来，证明酵母Meyerozyma guilliermondii SC1103可以在12小时内将100 mM的HMF转化为BHMF，产率为86%，此后人们探索了许多用于这一转化的整个细胞催化剂（Li等人，2017年）。随后，鉴定并应用了几种耐HMF的菌株，包括Paraburkholderia azotifigens F18（在12小时内从40 mM的HMF中产生92.2%的BHMF）、Aureobasidium subglaciale F134（在9小时内从180 mM的HMF中产生82%的BHMF）和Burkholderia contaminans NJPI-15（在6小时内从100 mM的HMF中产生95%的BHMF）（Chang等人，2021年；Chen等人，2021年；Xu等人，2020b年）。同时，也鉴定并应用了几种参与HMF还原的关键酶来构建重组整个细胞催化剂，包括表达NADH依赖性还原酶CmCR的大肠杆菌CCZU-K14（从200 mM的HMF中在72小时内产生90.6%的BHMF）、表达醇脱氢酶MgAAD1669的重组酿酒酵母（从250 mM的HMF中在24小时内产生94%的BHMF）以及表达还原胺酶AspRedAm变体的重组大肠杆菌BL21（从25 mM的HMF中在18小时内产生超过98%的BHMF）（He等人，2017年；Jia等人，2021年；Xia等人，2019年）。通过酶的发现、工程改造和辅因子再生策略的优化，HMF还原生物催化剂的持续进步进一步提高了BHMF的生产效率（Kornecki等人，2023年；Zhang等人，2025年）。在我们之前的工作中，我们分离出一种高度耐HMF的菌株Enterobacter ludwigii YYP3，并鉴定出两种负责HMF还原的短链脱氢酶/还原酶（SDR）家族氧化还原酶YkvO和SSP1627（Pan等人，2022年）。表达SSP1627的重组大肠杆菌能够在3小时内将50 mM的HMF转化为超过99%的BHMF。然而，在大多数情况下，只有在相对较低的HMF浓度下才能实现高催化效率，而在较高的底物浓度下，产物产量往往会显著下降，或者需要更长的反应时间，这主要是由于HMF对细胞的毒性（Faustino等人，2026年）。最近的研究探讨了微生物耐受性工程，包括适应性实验室进化和代谢工程，以提高细胞对HMF及相关呋喃醛的抵抗力（Jilani和Olson，2023年；Lechtenberg等人，2024年）。尽管如此，仍需要鉴定出更稳定的酶和/或应用蛋白质工程策略来开发能够在高HMF浓度下高效催化的生物催化剂，从而促进后续的规模化生产。目前，商业HMF的生产依赖于六糖的酸催化脱水，随后需要进行繁琐的纯化步骤（如吸附、提取或膜分离）（Boonyoung等人，2024年；Hu等人，2020年）。为了降低生产成本，通过一锅法化学-酶级联反应直接将 inexpensive 的碳水化合物（如果糖和葡萄糖）转化为BHMF是一个有吸引力的替代方案（Wu等人，2024年；Xia等人，2024年）。这种策略消除了HMF分离的需要，并提高了整体工艺效率。然而，由于化学催化剂和生物催化剂之间的固有不相容性，仔细选择合适的溶剂对于确保两个催化系统在单个反应容器中有效运行至关重要（Hu等人，2022年；Li等人，2025年）。由氢键供体和受体组成的深度共晶溶剂（DESs）因其易于制备和可调的物理化学性质而被广泛研究作为生物质转化的调控介质（Liu等人，2021年；Ren等人，2026年；Sathasivam等人，2026年）。包括甜菜碱：苯磺酸（Bet:BSA）、氯化胆碱：草酸（ChCl:OA）和甜菜碱：乳酸（Bet:LA）在内的几种DES系统已成功应用于一锅法级联反应中，将d-果糖转化为BHMF（Peng等人，2022年；Wu等人，2024年；Zhang等人，2021年）。然而，在实践中，DESs通常被稀释到相对较低的浓度（通常低于10 wt%）以支持后续的生物催化还原，因为较高的浓度可能会影响生物催化剂的性能（Qiu等人，2025年；Zhang等人，2023年）。先前的研究报告称，DES暴露会降低微生物的活力和生长，同时观察到膜完整性和通透性的变化（Azouz和Hayyan，2026年；Marchel等人，2021年；Zhang等人，2024年）。这些细胞效应受到DES组成和浓度以及各个组分的物理化学性质的影响（Ferreira等人，2022年）。此外，不同物种和菌株对DESs的反应可能存在显著差异（Azouz和Hayyan，2026年）。然而，不同DESs对整个细胞催化剂的影响，特别是对工业常用菌株如大肠杆菌的影响，在细胞和代谢水平上仍不充分了解，尤其是关于不同的DESs是否会引起共性的或DES特异性的细胞和代谢扰动。因此，阐明不同DESs如何干扰细胞生理和细胞内代谢，以及这些扰动最终如何影响整个细胞的催化性能是至关重要的。这种理解可以指导开发耐DES的整个细胞催化系统，并提高一锅法转化d-果糖为BHMF的工艺的稳健性。为了应对这些挑战，我们从E. ludwigii YYP3中鉴定出一种新型的SDR氧化还原酶HetN，它表现出优异的HMF还原活性。通过针对HMF和NADPH结合口袋的两轮定向突变，我们合理设计了一个双突变体T140Q/V39H，其催化效率显著提高。在优化条件下，该整个细胞催化剂能够在非常短的反应时间内实现高底物浓度下的HMF完全转化，并显示出优异的操作稳定性和重复使用性。随后在一个50毫升的制备规模反应中评估了这一过程，成功分离出纯度与商业标准相当的BHMF。基于这一稳健的催化系统，我们开发了一种一锅法化学-生物催化级联反应，将d-果糖转化为BHMF，总反应时间仅为0.5小时。重要的是，通过整合细胞活力、膜完整性、细胞内NADPH/NADP+的测量以及非靶向代谢组学研究，我们比较了重组大肠杆菌整个细胞催化剂对不同DESs的反应，揭示了与催化性能下降相关的共性和DES特异性的细胞和代谢扰动。总之，这项研究旨在开发一种在高HMF浓度下高效生产BHMF的稳健整个细胞催化剂，建立一种快速的一锅法化学-生物催化路线，并比较研究了重组大肠杆菌整个细胞催化剂对不同DESs的细胞和代谢反应。

部分摘要
化学品和试剂
HMF（99%）、BHMF（98%）、氯化胆碱（ChCl，99%）、草酸（OA，99%）、乳酸（LA，99%）和d-果糖（99%）购自Aladdin Co., Ltd.（美国加利福尼亚州）。苯磺酸（BSA，90%）和甜菜碱（Bet，98%）购自Macklin Co., Ltd.（中国上海）。Enhanced NADP+/NADPH Assay Kit（WST-8方法）和含DMAO及PI的LIVE/DEAD细菌活力Kit购自Beyotime Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）。所有其他生化试剂...

新型SDR氧化还原酶HetN的快速鉴定
在我们之前的工作中，从E. ludwigii YYP3中鉴定出两种氧化还原酶SSP1627和YkvO，并发现它们可以催化HMF的还原（Pan等人，2022年）。结构分析表明，这两种酶都属于SDR家族，并具有三个典型特征：（i）保守的N端富含Gly的基序（TGxxxGxG，其中x代表任意氨基酸）；（ii）由Ser、Tyr和Lys残基组成的保守催化三联体；以及（iii）具有α/β结构的经典Rossmann折叠（Xing等人，2021年）。

结论
总之，开发了一种过表达合理设计的HetN突变体（T140Q/V39H）的重组大肠杆菌整个细胞催化剂。这种生物催化剂在水性缓冲液中实现了高时空产率（从200 mM的HMF产生14.2 g·L?1·h?1的BHMF），并且在20个循环中保持了高催化效率。该工艺成功进行了放大，并建立了改进的下游分离方案，能够方便地分离出高纯度的固态BHMF，同时避免了柱层析的需要。