针对SARS-CoV-2核衣壳的小分子揭示了人类冠状病毒中一种普遍存在的RNA结合脆弱性

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Small Molecules Targeting SARS-CoV-2 Nucleocapsid Reveal a Conserved RNA-Binding Vulnerability Across Human Coronaviruses

　　

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  核衣壳（N）蛋白的RNA结合口袋在SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV中高度保守。
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  FDA批准的化合物头孢他啶和芸香苷A能够抑制这三种冠状病毒N蛋白的RNA结合。
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  电泳迁移率 shift分析和荧光极化实验证实了N蛋白与RNA相互作用的剂量依赖性抑制。
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  分子对接显示这两种抑制剂都作用于N端结构域RNA结合槽内的保守残基。
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  这些发现揭示了冠状病毒N蛋白中的一个可药物化且保守的脆弱性，为开发广谱冠状病毒治疗方法提供了支持。

引言

冠状病毒由于具有动物传人的能力、快速适应性和导致人类严重呼吸道疾病的能力，对全球健康构成了持续且重大的威胁。在过去的二十年里，出现了三种高致病性的β冠状病毒：2002年的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、2012年的中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）以及2019年的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。尽管SARS-CoV和MERS-CoV导致了局部但严重的疫情，但SARS-CoV-2引发了COVID-19大流行，造成了前所未有的全球发病率、死亡率和经济社会破坏。这些反复发生的疫情强调了需要广泛的抗病毒策略和持续的大流行准备。

冠状病毒拥有大约30 kb的大规模正链单链RNA基因组，编码非结构蛋白和结构蛋白。非结构蛋白包括RNA依赖性RNA聚合酶（nsp12）、主要蛋白酶（nsp5）和解旋酶（nsp13），它们对病毒复制至关重要，并一直是抗病毒药物研究的主要焦点。结构蛋白——刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）在病毒进入、组装和基因组包装中起着关键作用。刺突蛋白（S）尤为重要：SARS-CoV和SARS-CoV-2利用血管紧张素转换酶2（ACE2）作为受体，而MERS-CoV则利用二肽基肽酶4（DPP4/CD26）。尽管在受体使用和序列上存在差异，但这些冠状病毒具有保守的基因组组织和必要的复制机制，这突显了可用于治疗开发的共同脆弱性。

历史上，抗病毒策略主要集中在针对容易快速突变的病毒组分，如刺突蛋白或必需的病毒酶，如RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）和主要蛋白酶（Mpro）。这些方法导致了包括瑞德西韦（remdesivir）、莫努匹拉韦（molnupiravir）和中和单克隆抗体在内的治疗方法的发展。然而，这些干预措施的长期有效性受到病毒变异体的挑战，这些变异体会产生耐药性或免疫逃逸，同时还存在关于脱靶毒性和在不同患者群体中临床效果不一致的问题。

相比之下，核衣壳（N）蛋白是一种多功能RNA结合蛋白，对基因组包装、复制和免疫调节至关重要，在冠状病毒中是一个更为保守的目标。N蛋白是表达量最丰富的病毒蛋白之一，在其N端（NTD）和C端（CTD）结构域中表现出高度的序列和结构保守性。此外，它形成的相分离凝聚物有助于病毒组装，并能拮抗宿主的抗病毒应答，使其成为病毒致病性的核心。结构研究表明，N蛋白的N端结构域（NTD）包含一个在所有β冠状病毒中都保守的RNA结合槽，其特征是一个β片层“手掌”和一个基本的β发夹“手指”，这对于选择性地识别病毒RNA元素至关重要。尽管N蛋白具有关键功能和高程度的保守性，但它仍然是一个未被充分研究的抗病毒目标。

我们之前的工作发现了两种FDA批准的小分子——头孢他啶和芸香苷A，它们能够结合SARS-CoV-2的N-NTD并破坏其与RNA的相互作用。通过NMR化学位移扰动实验确定，这些抑制剂主要作用于β发夹环和手掌区域的保守残基。这些观察结果提示这些抑制剂可能对其他人类冠状病毒也具有广谱活性。基于这些发现，本研究调查了SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV中N-NTD RNA结合口袋的保守性，并评估了头孢他啶和芸香苷A抑制这三种病毒N蛋白RNA结合的能力。通过结合序列分析、生化实验和分子对接，我们证明了这些抑制剂针对冠状病毒N蛋白中的一个保守且可药物化的脆弱性，为开发广谱冠状病毒治疗方法提供了支持。

节片段

从SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV中克隆核衣壳蛋白

为了进行保守RNA结合结构的比较功能研究，我们生成了SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的核衣壳（N）蛋白的部分结构域构建体。使用之前描述的SARS-CoV-2构建体表达了Scov2-N_44–364（残基44–364），包括N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD），同时排除了无序的末端区域。同样地，也编码了MERS-CoV N蛋白的优化密码子基因片段（MCoV-N_39–362）。

冠状病毒核衣壳蛋白在不同致病株中表现出高度的序列保守性

为了评估高致病性人类冠状病毒中核衣壳（N）蛋白的进化保守性，我们对SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的循环株的全长N蛋白进行了多次序列比对（MSA），共包含17个序列：10种主要的SARS-CoV-2谱系/变异株（Alpha、Beta、Gamma、Delta以及最近的JN.1和KP.1.1），3种SARS-CoV株，以及4种现代MERS-CoV株（2016–2023年）。

讨论

本研究表明，冠状病毒核衣壳（N）蛋白的N端结构域（NTD）含有一个高度保守的RNA结合口袋，容易被小分子抑制。通过系统地比较SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的N蛋白，我们证实头孢他啶和芸香苷A能够抑制这些系统发育上不同的β冠状病毒的RNA结合。这种广谱抑制作用得到了……的支持。

CRediT作者贡献声明

Shweta Singh：写作——审稿与编辑，撰写初稿，验证，方法学研究，实验设计。 Gagan Deep Gupta：写作——审稿与编辑，撰写初稿，验证，监督，形式分析，概念构思。

利益冲突

无

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的情况说明

在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT来改进手稿的语言和可读性。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑，并对已发表文章的框架、准确性和最终内容负全责。

利益冲突声明

无

致谢

我们感谢PCS和BARC的Mukesh Kumar博士以及PCS和BARC的Subhash C Bihani博士的宝贵建议。本研究得到了印度原子能部门的资助。

Shweta Singh|Gagan D. Gupta