《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Low-intensity pulsed ultrasound enhances the secretion and pro-angiogenic activity of dental pulp stem cell-derived extracellular vesicles through activation of the FAK/AKT1 pathway
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摘要：细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是纳米级的膜性颗粒，通过向受体细胞传递生物活性物质介导细胞间通讯。EVs因其通过旁分泌信号调控血管生成、组织重塑和再生过程而被作为无细胞治疗剂进行研究。由于血管生成对组织修复与再生至关重
摘要：细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是纳米级的膜性颗粒，通过向受体细胞传递生物活性物质介导细胞间通讯。EVs因其通过旁分泌信号调控血管生成、组织重塑和再生过程而被作为无细胞治疗剂进行研究。由于血管生成对组织修复与再生至关重要，EVs调控内皮细胞增殖、迁移和管形成的能力日益受到关注。然而，基于EV的治疗策略的临床转化仍受限于生产效率不足及EV生物活性的变异性。因此，亟需能够同时提高EV产量并增强其功能效应的方法。在间充质干细胞来源中，牙髓干细胞（dental pulp stem cells, DPSCs）因其易获取性、增殖能力、多向分化潜能及旁分泌活性而备受关注。DPSC源性EVs含有来自母细胞的生物活性分子，已被作为潜在治疗剂进行研究。重要的是，DPSC源性EVs已在实验模型中显示出促血管生成效应。然而，在常规培养条件下，DPSC源性EVs的治疗应用仍受限于有限的EV产量和生物活性。因此，研究人员探索了预处理策略以优化EV产量和治疗潜力。低强度脉冲超声（low-intensity pulsed ultrasound, LIPUS）是一种非侵入性机械刺激方式，已被研究其再生效应。近期研究表明，LIPUS可修饰干细胞源性EVs的生物学特性。然而，LIPUS预处理是否能增加回收的DPSC源性EV制剂的产量，以及这些制剂是否在受体内皮细胞中表现出增强的促血管生成效应，尚不明确。机械刺激可激活黏着斑相关信号，包括FAK——一种机械转导和细胞迁移的关键调节因子。FAK信号也参与内皮细胞的血管生成反应，FAK在Tyr397位点的磷酸化与涉及PI3K/AKT激活的信号分子招募有关。然而，FAK/AKT1信号是否参与受体内皮细胞对LIPUS预处理的DPSC源性EVs的反应尚未明确。因此，本研究旨在确定LIPUS预处理是否能增加回收的DPSC源性EV制剂的产量，并增强DPSC源性EVs的促血管生成效应。研究人员进一步利用药理学抑制方法，研究了内皮FAK/AKT1信号是否参与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）对LIPUS预处理的DPSC源性EVs的反应。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
血管生成是组织修复与再生的核心环节，细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）作为纳米级膜性颗粒，可通过传递蛋白质、脂质和RNA等生物活性物质介导细胞间通讯，在调控内皮细胞增殖、迁移和管形成方面展现出重要潜力，因而被视为极具前景的无细胞治疗剂。然而，EV疗法的临床转化面临两大瓶颈：一是常规培养条件下EV产量不足，二是EV生物活性存在显著变异性。因此，亟需开发能够同时提升EV产量并增强其功能效应的预处理策略。
在众多间充质干细胞来源中，牙髓干细胞（dental pulp stem cells, DPSCs）因其易于获取、增殖能力强、具备多向分化潜能及活跃的旁分泌活性而成为研究热点。DPSC源性EVs已被证实可在实验模型中发挥促血管生成作用，但其临床应用同样受限于产量和活性不足。低强度脉冲超声（low-intensity pulsed ultrasound, LIPUS）作为一种非侵入性机械刺激手段，已被发现可调节多种干/祖细胞系统中EV的分泌及其介导的生物学效应。然而，LIPUS预处理能否提高DPSC源性EV的回收产量，以及经LIPUS预处理的EV是否具有更强的促血管生成活性，此前尚无明确结论。此外，机械刺激可激活黏着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）信号通路，而FAK及其下游的蛋白激酶B（AKT1）信号在内皮细胞血管生成反应中发挥关键调控作用，但这一信号轴是否参与LIPUS预处理DPSC源性EV对内皮细胞的作用亦属未知。
二、研究设计与主要结论
为回答上述问题，研究人员以DPSCs为EV供体细胞，以人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）为受体细胞模型，系统评估了LIPUS预处理对DPSC源性EV产量及促血管生成功能的影响，并探讨了FAK/AKT1信号通路的参与机制。研究得出以下主要结论：LIPUS预处理可在不影响DPSCs存活数量的前提下，显著提高回收的DPSC源性EV制剂的产量，其中0.25 W/cm2强度条件效果最佳；在蛋白浓度归一化（10 μg/mL）的条件下，LIPUS预处理的EV（LIPUS-EVs）相较于常规EV，能更显著地增强HUVECs的代谢活性、迁移能力和管形成能力；LIPUS-EVs处理可显著上调HUVECs中FAK和AKT1的磷酸化水平，而FAK抑制剂PF-573228可有效逆转这一效应并削弱LIPUS-EVs诱导的管形成增强，表明FAK/AKT1信号通路参与了LIPUS-EVs促血管生成作用的传导。
三、关键技术方法概述
研究人员采用了以下主要技术方法：使用临床超声系统（SZ-100 M）对DPSCs施加LIPUS刺激（频率1 MHz，占空比20%，脉冲重复频率100 Hz，强度分别为0、0.25、0.5 W/cm2，持续10分钟）；通过差速超速离心法（100,000 ×g，2小时）从条件培养基中分离EVs；采用可调电阻脉冲感应（tunable resistive pulse sensing, TRPS）分析EV粒径分布与浓度；利用透射电子显微镜观察EV形态；通过Western blot检测EV标志物（CD63、CD9）及阴性标志物钙联蛋白（Calnexin）；采用PKH26荧光标记结合荧光显微镜评估EV细胞摄取；运用CCK-8法测定细胞代谢活性；通过划痕愈合实验和Transwell迁移实验评估细胞迁移能力；采用Matrigel管形成实验评估血管生成能力；使用FAK抑制剂PF-573228进行药理学抑制实验；通过Western blot检测FAK和AKT1的磷酸化水平。
四、研究结果分述
3.1 LIPUS条件的优化及EVs与LIPUS-EVs的表征
台盼蓝排斥染色计数显示，LIPUS处理后48小时，各组DPSCs活细胞数量无显著差异。TRPS分析表明，所有组别EV制剂的粒径分布均符合小细胞外囊泡特征（约30–150 nm），组间粒径无显著差异。0.25 W/cm2组EV颗粒浓度最高，约为对照组的3倍，且显著高于0.5 W/cm2组。BCA蛋白定量结果显示，0.25 W/cm2组EV蛋白浓度亦显著高于对照组和0.5 W/cm2组。Western blot证实EV制剂表达CD63和CD9，而内质网标志物Calnexin仅在DPSCs中检出。透射电镜显示EVs和LIPUS-EVs均呈球形或杯状形态。据此，后续实验选用0.25 W/cm2作为LIPUS刺激条件。
3.2 LIPUS-EVs增强内皮细胞血管生成功能
浓度梯度实验确定10 μg/mL为后续功能实验的工作浓度。CCK-8检测显示，EVs和LIPUS-EVs均在48小时和72小时显著提高HUVECs代谢活性，且LIPUS-EVs在48小时的促进作用显著强于常规EVs。PKH26标记实验证实两种EV制剂均可被HUVECs摄取，定位于核周区域。划痕愈合实验和Transwell迁移实验一致表明，LIPUS-EVs较常规EVs更能促进HUVECs迁移。Matrigel管形成实验显示，在蛋白归一化剂量下，LIPUS-EVs在网格数、分支数、连接点数和总管长度等指标上均显著优于常规EVs。
3.3 LIPUS-EVs增加HUVECs中FAK和AKT1的磷酸化
Western blot分析显示，与对照组相比，常规EVs处理未显著改变p-FAK/FAK和p-AKT1/AKT1比值，而LIPUS-EVs处理则使这两个比值显著升高。加入FAK抑制剂PF-573228后，LIPUS-EVs诱导的FAK和AKT1磷酸化升高被明显抑制，恢复至接近对照组水平。
3.4 FAK抑制减弱LIPUS-EVs在HUVECs中的促血管生成效应
在管形成实验中，PF-573228显著削弱了LIPUS-EVs诱导的管形成增强效应，表现为网格数、分支数、连接点数和总管长度的显著下降，而单独使用PF-573228对基础管形成无明显影响。
五、讨论总结与结论翻译
讨论部分指出，本研究首次将LIPUS预处理应用于DPSC源性EVs，证实其可提高EV回收产量并增强其对HUVECs的促血管生成效应。研究强调，虽然LIPUS-EVs在蛋白归一化条件下表现出更强的功能效应，但由于蛋白归一化并不能等同颗粒数量，因此不应将这种增强简单归因于单个EV内在活性的提升。LIPUS可能改变了EV制剂的颗粒-蛋白比率，且更高颗粒丰度可能是功能增强的部分原因。研究还指出，FAK/AKT1信号通路参与了LIPUS-EVs对内皮细胞的作用，这与既往在其他细胞类型中发现的PI3K/AKT信号机制相呼应。此外，不同LIPUS强度对EV产量的差异化影响再次强调了参数优化的必要性。
研究结论翻译如下：综上所述，LIPUS预处理提高了DPSC源性EV制剂的回收产量，并在蛋白归一化条件下增强了它们对HUVECs血管生成相关功能的影响。研究结果还支持内皮FAK/AKT1信号参与这些反应。未来需采用等颗粒数归一化的研究来确定所观察到的功能差异在多大程度上反映了颗粒丰度或其他EV制剂特性。
