基于蛋白质组学鉴定的结核分枝杆菌糖蛋白作为活动性结核潜在生物标志物：用于痰液抗原检测的原型竞争性ELISA的建立

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Proteomic identification of Mycobacterium tuberculosis glycoproteins as potential biomarkers for active tuberculosis: Development of a prototype competitive ELISA for sputum antigen detection

　　

背景：蛋白质糖基化可影响结核分枝杆菌（MTB）蛋白的抗原性，但糖蛋白抗原在结核病（TB）抗原检测分析开发中仍研究较少。本研究对MTB糖蛋白进行富集与蛋白质组学鉴定，并建立原型竞争性酶联免疫吸附试验（ELISA）用于检测痰液中TB相关抗原物质。方法：采用伴刀豆球蛋白A（ConA）亲和层析富集MTB菌株TB-1039的糖蛋白，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、过碘酸-雪夫（PAS）染色和液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行表征。分别使用GlycoPP和免疫表位数据库（IEDB）预测N-糖基化和O-糖基化位点及线性B细胞表位。将纯化糖蛋白与辣根过氧化物酶（HRP）偶联，并使用从10例培养确诊活动性TB患者混合血清中纯化的抗体建立该检测方法。随后使用206份痰液标本对该方法进行评估，标本来自132例培养确诊活动性TB患者和74例无活动性TB的培养阴性对照参与者。结果：根据预测的糖基化与表位兼容性，筛选出13种糖蛋白（Rv3873、Rv0934、Rv1078、Rv0954、Rv0173、Rv0583c、Rv1270c、Rv1543、Rv0341、Rv1860、Rv2560、Rv0174和Rv0838）。6种候选蛋白（Rv0954、Rv0174、Rv1078、Rv0838、Rv0583c和Rv1860）的兼容性超过70%。竞争性ELISA的表观受试者工作特征（ROC）曲线下面积为0.951（95% CI 0.92–0.98；P < 0.001）。以同一批标本选定的≤0.65为临界值，表观灵敏度为90.15%（95% CI，83.7–94.7%），表观特异度为93.24%（95% CI，84.9–97.8%）。结论：ConA富集、LC-MS鉴定和计算机分析使MTB糖蛋白候选物得以优先排序，并支持开发用于痰液中TB相关抗原检测的原型竞争性ELISA。这些初步的单中心研究结果为后续优化提供了基础，但在临床应用前仍需在更大队列（包括适当的疾病对照组）中进行独立验证。

研究背景方面，结核病（TB）仍是全球重大公共卫生挑战。据世界卫生组织（WHO）2025年全球结核病报告，2024年新诊断并接受治疗的TB患者达830万例，但快速诊断可及性仍存在重要缺口。Xpert MTB/RIF Ultra与Xpert MTB/RIF是WHO推荐的核酸扩增检测，可快速识别MTB复合群及利福平耐药，但其应用依赖分子仪器、耗材和支持性基础设施，在资源有限环境中受到限制。培养法周转时间长，分子检测虽快但需专用设备与资源，这些局限促使研究人员寻找活动性TB的补充性抗原标志物。蛋白质糖基化是重要的翻译后修饰，可影响蛋白结构、定位、稳定性、抗原性及与宿主免疫组分的相互作用。MTB含有大量糖基化和糖脂蛋白，既往蛋白质组学研究通过ConA富集、LC-MS、GlycoPP和IEDB分析鉴定了293种候选糖蛋白。本研究在此基础上优先筛选部分糖蛋白，并开发针对痰液中TB相关抗原的原型抗体检测方法。研究目的是开发并表征基于糖蛋白的原型竞争性ELISA，用于检测痰液中TB相关抗原，并利用培养确诊的临床标本初步估计其表观鉴别性能。

研究人员开展了单中心概念验证研究，在伊朗巴斯德研究所结核病与肺部研究部进行，共纳入206例成年参与者，包括132例经痰培养微生物学确诊的活动性肺结核患者和74例无临床活动性TB证据且痰涂片与培养阴性的对照参与者。研究得出，竞争性ELISA的表观曲线下面积（AUC）为0.951，在≤0.65临界值下表观灵敏度为90.15%、表观特异度为93.24%。结论指出，ConA富集、LC-MS鉴定与计算机分析支持MTB糖蛋白候选物优先排序及原型竞争性ELISA的开发，但这些单中心初步结果需在更大队列及含适当疾病对照组的独立验证后方可用于临床。其意义在于为基于糖蛋白的TB抗原检测提供了初步分析基础，并提示糖蛋白候选物具有免疫学相关性，值得作为抗原靶点进一步研究。

关键技术方法方面（不超过250字）：采用ConA亲和层析富集MTB菌株TB-1039糖蛋白，经SDS-PAGE与PAS染色表征，并行LC-MS/MS鉴定；用GlycoPP预测N-/O-糖基化位点、IEDB的BepiPred-2.0预测线性B细胞表位；将纯化糖蛋白经高碘酸钠氧化法与HRP偶联；以10例培养确诊活动性TB患者混合血清经CNBr活化Sepharose 4B亲和纯化抗糖蛋白抗体；建立竞争性ELISA并以ROC曲线分析确定临界值。样本队列来源为伊朗巴斯德研究所，206份痰液标本来自132例培养确诊活动性TB患者与74例培养阴性对照参与者。

研究结果方面，3.1糖蛋白鉴定与候选筛选：通过ConA富集、LC-MS鉴定结合GlycoPP与IEDB预测，在?1.0至1.0评分阈值范围内评估性能并确定最优阈值，最终选出13种预测糖基化位点与抗原序列高度兼容的糖蛋白，其中6种（Rv1078、Rv0954、Rv0583c、Rv0174、Rv0838、Rv1860）兼容性百分位超过70%，且糖基化残基位于预测免疫原性表位内或邻近区域，多数为表面暴露或膜相关蛋白。3.2纯化抗体的免疫层析评价：用206份痰液标本经免疫层析检测，得出表观灵敏度92.4%（122/132）、特异度94.6%（70/74）、阳性预测值96.8%、阴性预测值87.5%、总诊断效率93.2%，均为同一批标本的表观估计。3.3 HRP-糖蛋白偶联物与滴定：测得OD₄₀₃为0.40、OD₂₈₀为0.857，RZ值为0.46，符合免疫分析用偶联物可接受水平；偶联物与包被抗体结合后经底物显色产生可测信号，并绘制系列稀释滴定曲线。3.4竞争性ELISA与ROC结果：206例中132例（64.1%）为活动性TB、74例（35.9%）为对照；性别与研究分组无显著关联（χ²(1, N = 206) = 0.19，P = 0.67），年龄组间无显著差异（43.80 ± 12.10岁 vs 42.30 ± 12.60岁；Welch t检验，P = 0.41）；表观AUC为0.951（95% CI 0.92–0.98），显著大于0.5（z = 31.6，P < 0.001）；最大Youden指数（J = 0.834）对应临界值≤0.65，此时表观灵敏度90.15%（119/132）、表观特异度93.24%（69/74）。因临界值在同一批标本上选定与评价，上述估计可能高估独立人群中的诊断性能。

讨论部分总结：研究人员指出，活动性肺结核诊断主要依赖微生物学与分子方法，培养法周转时间长、分子检测需专用设备与资源，故需寻找补充性抗原标志物。本研究基于计算预测筛选候选物，应理解为候选优先排序而非对每种蛋白糖基化或免疫原性的实验确证；ConA亲和层析可在LC-MS鉴定前富集含甘露糖的糖蛋白，本研究沿用既往工作但以纯化糖蛋白制备开发原型抗体检测并估计其临床标本表观性能。免疫层析显示纯化抗体可识别临床标本中的TB相关物质，竞争性ELISA显示较高表观鉴别性能，但均为表观内部估计，尚不能确立诊断准确性。研究还讨论了Rv3873、Rv0934（PstS-1）、Rv0954、Rv1270（LprA）、Rv0341等蛋白的免疫学与生物学背景，以及糖基化在宿主-病原相互作用和免疫识别中的可能作用，并提及阿拉伯甘露聚糖（AM）等碳水化合物抗原及宿主免疫标志物的潜在价值。局限性包括：临界值在同一批206份标本上选定与评价且无独立验证队列或内部交叉验证；单中心设计且缺乏非结核分枝杆菌感染和其他呼吸系统疾病等疾病对照；抗体仅来自10例患者混合血清，所用为ConA富集糖蛋白混合物而非单一重组蛋白，无法将诊断信号归因于特定蛋白；计算预测的糖基化位点与表位未经实验验证；重复测量仅为技术重复，未记录完整检测的独立重复；LC-MS/MS序列数据库及版本、分类范围、肽段与蛋白鉴定标准、FDR阈值、色谱柱内径、批间变异及检测限等信息不可得。

结论翻译：本研究描述了MTB糖蛋白的富集与蛋白质组学鉴定、依据预测糖基化与表位兼容性对候选物的优先排序，以及用于痰液中TB相关抗原的原型抗体竞争性ELISA的开发。在该单中心数据集中，该检测显示出较高的表观鉴别性能（AUC 0.951），但这些估计来自用于选定临界值的同一批标本，尚未经独立验证。这些糖蛋白候选物具有免疫学相关性，值得作为抗原靶点进一步研究；其或本文所述检测能否有助于TB诊断仍有待确定。需要在更大且多样化的临床人群（包括疾病对照组）中进一步验证，以确定基于糖蛋白方法的诊断准确性、重现性和可行性。